牛布鲁氏菌Omp25基因的克隆与原核表达及抗原特异性研究.pdf

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1、分类号S852学校代码10129UDC577学号08201084牛布鲁氏菌Omp25基因的克隆与原核表达及抗原特异性研究CloningandProkaryocyticExpressionofOmp25GeneofBrucellaAbortusandStudiesofAntigenSpecificity申请人：刘艳琴学科门类：农学学科专业：临床兽医学研究方向：反刍动物抗病性研究指导教师：吴树清教授论文提交日期：二〇一一年四月摘要布鲁菌(Brucella)是革兰氏阴性兼性的细胞内寄生菌，是一种由布鲁菌引起的人畜共患传染病,给畜牧业的发展和人

2、类的健康造成极大的危害。准确的诊断对有效控制和消灭布鲁菌病是相当重要的，探索寻找合适的布鲁菌诊断性抗原一直是人们的目标，所以具有免疫原性和抗原保护作用的布鲁菌外膜蛋白就成为了研究的热点。本试验从GeneBank中下载编码布鲁菌外膜蛋白的基因，分析选取目前所有布鲁菌基因序列同源性高的基因进行研究。通过分析选取了牛布鲁氏菌A544的Omp25基因对其进行初步研究，利用PCR方法从流产布鲁菌基因组DNA中扩增出外膜蛋白基因Omp25，大约642bp的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶EcoRI、XhoI双酶切后直接与经双酶切的表达载pGE

3、X-6p-1连接，将该片段克隆于原核表达载体pGEX-6p-1中，之后将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21。重组载体的菌液经PCR鉴定、重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定证明，成功扩增出了目的基因，并且将其成功重组到了表达载体pGEX-6p-1中，重组菌在0.5mmol/L的IPTG条件下诱导4h时目的蛋白表达量达到了高峰。表达融合蛋白质分子量约为49kDa，以包涵体形式存在。提取包涵体后用电洗脱方法纯化融合蛋白，经western-blotting分析重组表达融合蛋白Omp25的反应原性，发现该蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗

4、血清。进而用B.suisS2作为菌体抗原包被,用所制的血清作为一抗，羊抗兔IgG为二抗。进行ELISA检测，进一步探索获得的蛋白作为诊断蛋白的可能性。本试验成功构建了pGEX-Omp25重组载体，并通过ELISA、Western-blotting分析及特异性检测试验，证明目的蛋白不仅具有抗原性且有良好的免疫反应。我们最终用ELISA方法证明该蛋白质作为诊断性抗原的可能性，该结果为研究该蛋白功能和布鲁氏菌诊断抗原奠定了基础。关键词：流产布鲁菌A544；外膜蛋白25；原核表达；免疫特性*项目来源：“十一五”国家重大科技攻关制成项目，（200

5、6BAD4A16-4）主持人：吴树清CloningandProkaryocyticExpressionofOmp25GeneofBrucellaAbortusandStudiesofAntigenSpecificityAbstractBrucellaisaGram-negativefacultativeintracellularparasiticbacteria.ItisazoonoticdiseasethatwascausedbybrucellaSPPandseveresaffecttinghumanshealthandthedeve

6、lopmentofanimalhusbandry.Accuratediagnosisisveryimportantforeffectivecontrolanderadicationofthebrucellosisandresearchingasuitablebrucelladiagnosticantigenistheaimofthepeople，Therefore,theBrucellaoutermembraneproteinwhichistoimmunogenicityandprotectiveantigensisbecomingre

7、searchesfocus.ThegeneofBrucellaoutermembraneproteinwasdownloadedfromGenBank.ThegenewasselectedbyanalysisthatshowedhighgenehomologousoftheBrucellaspeciesatpresent.TheexperimentselecttheOmp25ofB.abortusA544forthePreliminarystudy.Inthestudies,agenerecodingouetrmembraneporte

8、in25kDawasamplifiedfromthegenomicDNAtemplateofB.abortusbyPolymerasechainreaction(PCR)technique.Afragmen