医学毕业论文--重组人jo自身抗原的克隆、 原核表达及抗原特异性鉴定

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1、重组人Jo1自身抗原的克隆、原核表达及抗原特异性鉴定作者：赵晓瑜,毕智丽,吴亦红,辛海涛【摘要】　　目的:旨在获得高纯人Jo1抗原（即组氨酰tRNA合成酶）。方法:利用RTPCR从人胎盘总RNA中获得Jo1的编码基因,并分别用IMPACTCN和pMAL系统的pTYB11、pMALc质粒,构建了表达载体,转化至大肠杆菌ER2566、BL21。结果:经筛选与鉴定,得到阳性重组子诱导表达后均获得Jo1融合蛋白。Westernblot显示,这两种融合蛋白都具有Jo1抗原特异性,即仅与含Jo1抗体的多肌炎和皮肌炎自身免疫病患者血清反应,而与正常人以及188例含有其他自身抗

2、体（分别为RNP阳性、Sm阳性、Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）的患者血清均为阴性反应。结论:在两种表达载体中,pMALcJo1的表达量超过菌体蛋白的50％,而且以可溶性形式存在,有利于分离纯化,为临床检测创造了条件。【关键词】Jo1;基因;表达;抗原特异性　　氨酰tRNA合成酶是胞内酶,由“管家”基因编码,可在所有组织中表达,13主要催化包括蛋白质合成过程中的氨基酸活化和氨酰tRNA复合物的形成两步反应。人组氨酰tRNA合成酶（HSHRS）还是一类结缔组织病（自身免疫疾病）中的横纹肌弥漫性炎症疾患多肌炎（polymyositis,PM）和皮肌炎(dermatomy

3、ositis,DM)的标志性自身抗原［1,2］,临床上称之为Jo1,相对分子质量（Mr）为55000,由509个氨基酸组成,基因全长1527bp［3,4］。因PM和DM患者的血清中含有特异性的抗Jo1抗体,故Jo1可用于临床鉴别和诊断多肌炎和皮肌炎［5-8］。我们利用基因重组的方法获得重组Jo1自身抗原,为开发自身抗体的临床检测试剂创造了条件。　　1材料和方法　　1.1材料质粒pTYB11、pMYB5,大肠杆菌ER2566、BL21为BioLab公司产品。TRIzolReagent为Invitrogen公司产品。MMLVReverseTranscriptase、T4DNA

4、Ligase为Promega公司产品,SpeI、PstI为TaKaRa公司产品。正常人血清、Jo1阳性血清和各种结缔组织病阳性血清,来自北京协和医院、首都医科大学和天津长征医院,二抗羊抗人IgGHRP,由北京生物制品所生产。　　1.2方法　　1.2.1重组质粒的构建液氮速冻人胎盘组织,TRIzol法提取总RNA。根据GenBank注册序列X05345,利用PrimerPremier5.0软件设计嵌套引物进行反转录和巢式PCR,13获得Jo1全长基因。SpeI、PstI双酶切质粒pTYB11、pMALc,并对线性质粒进行去磷酸化,用T4连接酶将回收的双酶切pTYB11、pMA

5、Lc与目的DNA片段进行连接,获得带有Jo1基因的重组质粒,应用CaCl2法将重组质粒转化大肠杆菌ER2566、BL21菌株。　　1.2.2重组子的筛选与鉴定pTYB11和pMALc质粒载体携带有氨苄青霉素抗性基因,以氨苄终浓度为0.1g/L配制LB平板初筛转化子。提取转化子质粒,琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小,并用质粒作模板进行特异性扩增和双酶切鉴定。利用pTYB11载体自带的正向测序引物以及设计中间引物由上海联合基因科技（集团）有限公司进行全基因测序,利用BLASTn对测序结果进行序列同源性分析。　　1.2.3Jo1基因在大肠杆菌ER2566、BL21中的诱导表达与产物分析

6、37℃过夜菌转接后培养至A600为0.8左右,IPTG（终浓度0.3mmol/L）30℃诱导培养6h后收集部分菌体,直接进行SDSPAGE分析,其余菌体进行超声波破碎（缓冲液:50mmol/LTrisHCl,0.5mmol/LEDTA,9g/LNaCl,50g/L甘油）,分别对上清和沉淀进行100g/LSDSPAGE。将100g/LSDSPAGE胶上样品转移到PVDF膜上,分别用两份Jo1阳性血清、12例正常人和188例其他自身免疫性疾病患者血清（包括RNP阳性、Sm阳性、Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）进行Western13blot检测。　　2结果　　2.1Jo1基

7、因的获得根据GenBank中的编码人组氨酰tRNA合成酶的mRNA（X05345）的成熟蛋白编码序列,利用PrimerPremier5.0软件设计嵌套引物:引物I:5′ACAGCAGGCGGCTCAAGT3′;引物Ⅱ:5′TAACCTCAAATAGTGCCAGTCC3′;引物III:5′GACTAGTGCAGAGCGTGCGCCGCTG3′;引物Ⅳ:5′GGTGGTCTGCAGTCATGCCAGTCCCACTTCCTTTC3′,其中引物Ⅲ和引物Ⅳ的5′