临床医学毕业论文重组人jo1自身抗原的克隆、原核表达及抗原特异性鉴定

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1、XX大学毕业论文重组人Jo1自身抗原的克隆、原核表达及抗原特异性鉴定2014年6月25日重组人Jo1自身抗原的克隆、原核表达及抗原特异性鉴定作者：赵晓瑜，毕智丽，吴亦红，辛海涛【摘要】目的：旨在获得高纯人Jo1抗原（即组氨酰tRNA合成酶）。方法：利用RTPCR从人胎盘总RNA屮获得Jo1的编码基因，并分别用IMPACTCN和pMAL系统的pTYBlkpMALc质粒，构建了表达载体，转化至大肠杆菌ER2566.BL2U结果：经筛选与鉴定，得到阳性重组子诱导表达后均获得Jo1融合蛋白。Westernblot显示，这两种融合蛋白都具有Jo1抗原特异性，即仅与含Jo1抗体的多肌炎和皮肌炎自身

2、免疫病患者血清反应，而与正常人以及188例含有其他自身抗体（分别为RNP阳性、Sm阳性、Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）的患者血清均为阴性反应。结论：在两种表达载体中,pMALcJo1的表达量超过菌体蛋白的50%,而且以可溶性形式存在，冇利于分离纯化，为临床检测创造了条件。【关键词】Jo1;基因；表达；抗原特异性氨酰tRNA合成酶是胞内酶，由“管家〜基因编码，可在所冇组织屮表达,主要催化包括蛋口质合成过程中的氨基酸活化和氨酰tRNA复合物的形成两步反应。人组氨酰tRNA合成酶（HSHRS）还是一类结缔组织病（自身免疫疾病）屮的横纹肌弥漫性炎症疾患多肌炎（polymyositis,PM

3、）和皮肌炎（dennatomyositis,DM）的标志性自身抗原［1,2］，临床上称之为Jo1,相对分子质量（Mr）为55000,由509个氨基酸组成，基因全长1527bp［3,4］。因PM和DM患者的血清中含有特异性的抗Jo1抗体，故Jo1可用于临床鉴别和诊断多肌炎和皮肌炎［5-8］o我们利用基因重组的方法获得重组Jo1自身抗原,为开发自身抗体的临床检测试剂创造了条件。1材料和方法1」材料质粒pTYBIKpMYB5,大肠杆菌ER2566.BL21为BioLab公司产品。TRIzolReagent为Invitrogen公司产品。MMLVReverseTranscriptase、T4D

4、NALigase为Promega公司产品，SpeI>PstI为TaKaRa公司产品。正常人血清、Jo1阳性血清和各种结缔组织病阳性血清，来自北京协和医院、首都医科大学和天津长征医院，二抗羊抗人IgGHRP,由北京生物制品所生产。1.2方法121重组质粒的构建液氮速冻人胎盘组织,TRIzol法提取总RNA。根据GenBank注册序列X05345,利用PrimerPremier5.0软件设计嵌套引物进行反转录和巢式PCR,获得Jo1全长基因。SpeI、PstI双酶切质粒pTYBIKpMALc,并对线性质粒进行去磷酸化，用T4连接酶将回收的双酶切pTYBIKpMALc与口的DNA片段进行连接

5、，获得带有Jo1基因的重组质粒，应用CaC12法将重组质粒转化大肠杆菌ER2566、BL21菌株。1.2.2重组了的筛选与鉴定pTYBl1和pMALc质粒载体携带有氨节青霉索抗性基因，以氨节终浓度为0」g/L配制LB平板初筛转化子。提取转化子质粒，琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小，并用质粒作模板进行特异性扩增和双酶切鉴定。利用pTYBll载体自带的正向测序引物以及设计中间引物由上海联合基因科技（集团）冇限公司进行全基因测序，利用BLASTn对测序结果进行序列同源性分析。1.2.3Jo1基因在大肠杆菌ER2566、BL21屮的诱导表达与产物分析37°C过夜菌转接后培养至A600为0.8左右,I

6、PTG（终浓度0.3mmol/L）30°C诱导培养6h后收集部分菌体，直接进行SDSPAGE分析，其余菌体进行超声波破碎（缓冲液：50mmol/LTrisHC1,0.5mmol/LEDTA,9g/LNaCl,50g/L甘油），分别对上清和沉淀进行100g/LSDSPAGEo将100g/LSDSPAGE胶上样品转移到PVDF膜上，分别用两份Jo1阳性血清、12例正常人和188例其他口身免疫性疾病患者血清（包描RNP阳性、Sm阳性、Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）进行Westernblot检测。2结果2.1Jo1基因的获得根据GenBank屮的编码人组氨酰tRNA合成酶的mRNA（X05

7、345）的成熟蛋白编码序列,利用PrimerPremier5.0软件设计嵌套引物：引物I:5，ACAGCAGGCGGCTCAAGT3：引物II:5'TAACCTCAAATAGTGCCAGTCC3';弓I物III:5GACTAGTGCAGAGCGTGCGCCGCTG3：弓

8、物IV:5，GGTGGTCTGCAGTCATGCCAGTCCCACTTCCTTTC3；其屮引物III和引物IV的5端分别加了限制性内切酶SpeI、PstI酶切位点和保护性碱基。