布鲁氏菌保护性抗原在卡介苗中的表达研究

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1、分类号：密级：学号：2009108024单位代码：10759石河子大学硕士学位论文布鲁氏菌保护性抗原在卡介苗中的表达研究学位申请人诸婷婷柳建新副教授指导老师王远志副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物病理学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2012年6月ExpressionandresearchonprotectiveantigenofBrucellainBCGADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirements

2、FortheDegreeofMasterofAgricultureByZhuTingTing(BasicVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:LiuJianxinWangYuanzhiJune,2012课题来源兵团博士基金课题编号：2009JC15学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师指导下进行的研究工作及取得的科研成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已发表和撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示感谢。研究生签名：时

3、间：年月日学位论文版权授权书本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门和指定机构送交论文的电子版或纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月中文摘要布鲁氏菌病，简称布病，是由布鲁氏菌引起的以流产和发热为特征的一种人畜共患传染病。人感染后常表现为持续性感染，造成多器官的损害,临床表现为持续数日乃至数周发热（包括低热），

4、多汗，肌肉和关节酸痛，乏力，兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等可疑症状及体征。近年来，疫情出现回升势头。控制布鲁氏菌病的主要手段依旧是疫苗免疫。目前人常使用的布鲁氏菌疫苗是104M。该疫苗对人的布病预防起到积极有效作用，但人接种104M后，有较强的副作用，严重影响到布病高危人群对该疫苗使用的积极性。因此，研制一种副作用小、保护力强的新型疫苗势在必行。本研究以BCG苗为模板扩增出Ag85B的DNA片段，并与pBS-T载体连接，连接产物和pMV261用EcoRI/HindⅢ双酶切，回收产物用T4DNA聚合酶连接得到[1]pMV261-Ag85B载体，同时

5、以羊种布鲁氏菌生物3型05/43株（新疆地区分离的强毒株）为模板，克隆编码bp26和omp25的DNA片段，并与pBS-T载体连接得到pBS-T-bp26和pBS-T-omp25，然后分别用EcoRI/HindⅢ、EcoRI/SalⅠ双酶切pBS-T-bp26、pMV261-Ag85B及pBS-T-omp25、pMV261-Ag85B并回收目的产物，经T4DNA聚合酶连接得到pMV261-Ag85B-bp26和pMV261-Ag85B-omp25。取重组穿梭质粒pMV261-Ag85B-bp26和pMV261-Ag85B-omp25转化到BCG电

6、感受态细胞，对获得的重组疫苗株进行PCR鉴定；布鲁氏菌bp26重组卡介苗阳性株（rBCG-bp26和rBCG-omp25）液体培养基中摇菌培养，对其菌液进行westernblot检测。用布鲁氏菌M5-90疫苗株、rBCG-bp26和rBCG-omp25和BCG疫苗株分别免疫SPF级++BALB/c小鼠，通过流式细胞术检测小鼠外周血中CD4和CD8T细胞的含量，纯化BP26和OMP25蛋白为抗原，rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠血清为一抗，利用westernblot重组疫苗免疫动物的血清学检测，免疫小鼠肝脏和脾脏做组织切片HE染色，

7、观察组织病理变化。本研究主要获得如下结果：1.经酶切、PCR和DNA测序鉴定:表明所克隆的信号肤Ag85B片段和bp26、omp25片段与文献报道一致，pMV261-Ag85B-bp26、pMV261-Ag85B-omp25，的序列正确，连接方向正确，阅读框与预期一致。成功获得重组疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp25。2.采用电穿孔技术成功构建rBCG-bp26和rBCG-omp25：以重组菌株为模板，通过PCR扩增得到bp26、omp25的基因片段，westernblot印迹证实rBCG分泌的蛋白能与布鲁氏菌的抗体特异性结合，证实rB

8、CG具有免疫原性。3.安全性试验结果表明，PBS组、BCG组、rBCG-bp26和rBCG-omp25重组卡介苗组在体征和体重方面无显著