牛种布鲁氏菌2308基因缺失株经紫外线照射后对昆明系小鼠的免疫效果研究

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2、中国？新疆？石河子２０１５年１０月分类号：密级：学号：2013408021单位代码：10759石河子大学硕士学位论文牛种布鲁氏菌2308基因缺失株经紫外线照射后对昆明系小鼠的免疫效果研究学位申请人张欢指导教师陈创夫教授申请学位类别专业硕士专业名称兽医硕士研究领域兽医技术服务所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年10月TheeffectofafterUVirradiationB.abortus2308genemutationonKunmingmiceimmunizationADissertationSubmittedtoShihez

3、iUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByZhanghuan(Masterofscienceinveterinarymedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuOctober2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声１１学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进ｆ的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论

4、文不包含其他个／ｖ已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究ｊ，做出重要贡献的个人和集体均己在文中作了明确尚说明并表示谢意。ＩＩ研究生签名：张欢：ｆ月曰；时间公年／；＞使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部口或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。张次巧＊义研究生签名：１（＾

5、时间：月占／曰＾＞姐＾（削币签名：时间：牟ｎ句之／自课题来源国际科技合作项目项目名称：新型布鲁氏菌疫苗制备技术的引进与应用项目编号：S2013ZR0176牛种布鲁氏菌2308缺失株毒力致弱及其对昆明系小鼠的免疫效果评价摘要布鲁氏菌是一种革兰氏阴性胞内寄生菌，对人和动物易感，近些年，我国布病的发病率正在呈上升趋势，对经济和健康带来了严重的危害，但是现有疫苗仍然存在一定缺陷，为了能够研制出一种新型疫苗，本试验采用传统的物理方法对牛种布鲁氏菌2308缺失株进行诱变，缺失株为本试验室所构建，将2308△ery、2308△wbkA、2308△om

6、p25-3缺失株在37℃摇床中培养至OD值为0.6左右，用PBS稀释至10后，用移液器吸取50μL在布鲁氏菌固体培养基上涂匀，然后在紫外灯下30cm处分别照射0min、4min、6min、8min、10min后放入37℃恒温培养箱3～5d，挑取单菌落，至此为第一代，共诱变20代，然后送至中国疾控中心进行生化鉴定。为了检测牛种布鲁氏菌2308紫外诱变株毒力和免疫效果，本试验以S19疫苗株为对照，用牛种布鲁氏菌基因缺失株紫外线照射组（2308△rwbkA、2308△romp25、和2308△rery）和非照射组（2308△wbkA、2308△omp25

7、、和2308△ery）分别侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7，对小鼠巨噬细胞内的细菌进行计数评价毒力致弱情况；用牛种布鲁氏7菌基因缺失株紫外照射组、非照射组以及S19疫苗株分别以1×10CFU/0.2mL免疫4～6周龄昆明系小鼠，通过ELISA检测小鼠血清中布鲁氏菌IgG抗体和IFN-γ细胞因子，同8时分离脾脏，CFU计数布鲁氏菌胞内菌数量；用2308强毒株以3×10CFU/0.2mL腹腔感染各组免疫10周后小鼠，脾脏CFU评价各受试组小鼠的免疫效果。结果表明：在细胞水平，紫外线照射后的布鲁氏菌基因突变株其CFU较紫外线非照射组有不同程度的下降，统计

8、学分析无显著性差异（P＞0.05），但均高于S19胞内菌CFU；与S19疫苗株相比，2308△rwbkA和2308△rer