布鲁氏菌s2308株ery启动子缺失株的构建及wboa抗原表位的分析验证

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1、分类号：密级：请注明密级及保密期限学号：2009108036单位代码：10759石河子大学硕士学位论文布鲁氏菌S2308株ery启动子缺失株的构建及wboA抗原表位的分析验证学位申请人孟仁陈创夫教授指导教师张辉副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国〃新疆〃石河子2012年4月ConstructionandpreliminaryevaluationofimmuneeffectsofS2308△erystrainsandtheanalys

2、isofwboAADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByMengren(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuApril,2012石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导

3、师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的

4、学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日课题来源973计划项目项目名称：布鲁氏菌侵染与胞内寄生的分子机制研究项目编号：2010CB530203国家自然科学基金项目项目名称：布鲁氏菌侵染胚胎滋养层细胞过程中关键分子的功能研究项目编号：31001046S2308株ery启动子缺失株的构建及wboA基因的抗原表位分析验证摘要布鲁氏菌病（Brucellaabortus）是革兰氏阴性菌，专性细胞内寄生，可感染人类及多种动物引起发热、流产、不育、慢性关节炎及神经损伤等，导致世界

5、范围严重的经济损失和公共卫生问题。目前尚没有有效的防治手段，疫苗接种是预防该病的主要手段。藓醇激酶（ery）是流产布鲁氏菌的毒力基因，本研究通过对牛种布鲁氏菌S2308株ery启动子基因敲除构建ery启动子基因缺失株，观察是否可降低毒力；评价该缺失株作为疫苗候选株的价值；同时表达了eryA蛋白，为区别布鲁氏菌自然感染与疫苗免疫提供包被抗原；另外，S19疫苗株在防治牛布病方面取得明显的效果，但是牛种布鲁氏菌疫苗S19免疫怀孕的动物可能导致其流产，且常规的血清学检测与诊断方法不能将其与自然感染相区分，这

6、对我国布病的防治与净化是不利的。前期研究表明布鲁氏菌WboA基因编码糖基转移酶，是合成LPSO-侧链多糖的必需基因之一，M5-90wboA敲除株可以区别自然感染和疫苗感染。但M5-90敲除WboA株保护率比亲本株降低10%本研究拟对S19wboA基因的抗原表位分析并构建自杀载体为S19疫苗株的进一步改造提供科学依据。本研究以灭活的流产布鲁氏菌S2308株为模板，扩增赤藓醇激酶（ery）启动子基因的上下游同源臂序列；以枯草芽孢杆菌为模板，扩增SacB基因序列。将扩增好的序列分别连接到自杀载体pGEM-

7、7Zf+上，成功构建了pGEM-7Zf-ery-sacB自杀载体，将构建好的载体命名为：pes，然后将pes电转至流产布鲁氏菌S2308株感受态细胞，通过同源重组的方法成功构建S2308ery启动子基因缺失株，命名为：S2308Δery，对S2308Δery株进行了遗传稳定性检测，传至15代遗传稳定。用S2308Δery株侵染胚胎滋养层细胞，细胞脱落结果显示：S2308Δery株的毒力较亲本S2308株明显下降，其毒力与S19株相当。该缺失株通过缺失S2308ery启动子基因，将ery整个开放阅读框

8、失活，为S2308株向疫苗株的改造奠定基础。用DNAman和GENGrunner对wboA基因进行了抗原表位分析，选取抗原表位1（w-1）、抗原表位2(w-2)、抗原表位1和2（w-1-2）及wboA作为本试验的研究对象。以灭活的S19为模板，成功扩增了wboA基因及其3个抗原表位基因；以灭活的流产布鲁氏菌S2308株为模板，成功扩增了eryA基因。本试验成功构建了wboA基因及其抗原表位基因和eryA基因的原核表达载体，IPTG诱导表达，SDS-PAGE凝胶电泳显示