布鲁氏菌s2308asly缺失株构建及其生物学特征研究

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1、摘要布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人、畜共患传染病，该病在世界范围内广泛流行并严重危害着人、畜健康。体内诱导基因与病原菌在宿主体内的生存和致病过程相关，开展对体内诱导基因在布鲁氏菌致病过程中的作用研究,对阐明布鲁氏菌病的发生发展以及致病机制具有参考意义。精氨基琥珀酸裂解酶（argininosuccinatelyase，Asly）是由本实验室筛选和鉴定的布鲁氏菌体内诱导抗原，为进一步探讨Asly在布鲁氏菌体内感染过程中的作用，研究通过制备Asly单克隆抗体、构建Asly缺失株，开展对Asly生物学功

2、能研究，探讨Asly在布鲁氏菌致病过程中的致病机制。试验主要包括以下内容：先以布鲁氏菌S2308的基因组为模板扩增Asly基因的全长序列，将其克隆到原核表达载体pET-28a上，构建重组表达质粒pET28a-Asly，转化大肠杆菌BL21后，进行诱导表达，SDS-PAGE检测结果表明，融合蛋白His-Asly以可溶性方式表达。大量表达Asly融合蛋白，并用层析柱纯化可溶性的融合蛋白His-Asly。Westernblot检测结果表明融合蛋白His-Asly有免疫原性。使用纯化的His-Asly免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融

3、合，用His-Asly蛋白为包被抗原，使用间接ELISA方法对融合细胞进行筛选，最终获得了一株稳定分泌Asly单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为A5F2。BALB/c小鼠腹腔接种杂交瘤细胞制备单抗腹水，采用间接ELISA方法和WB方法检测单抗腹水效价，同时鉴定单抗的特异性和稳定性。单抗鉴定结果表明，A5F2的单抗腹水效价为5.12×106，WB鉴定结果表明，该株杂交瘤细胞产生的单抗具有很强的特异性。构建自杀质粒pUC19-U-C-D，将自杀质粒电转化入S2308感受态细胞，利用同源重组使氯霉素抗性片段完全取代Asly基因的ORF。PCR筛选、鉴定

4、双交换的重组阳性菌株。阳性菌株以Asly单抗腹水作为一抗进行WB检测，结果表明，S2308野毒株的全菌蛋白能被Asly单抗腹水识别，而Asly基因缺失的菌株不能被识别。以上结果表明成功构建了S2308ΔAsly缺失株。用S2308野毒株和构建的S2308ΔAsly缺失株感染MΦRAW264.7，提取细胞RNA并反转录，以本研究室建立的实时荧光定量(real-time)PCR方法检测和分析S2308野毒株和构建的S2308ΔAsly感染RAW264.7后，RAW264.7细胞的TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10共6种

5、细胞因子的转录水平的差异。结果表明：缺失株侵入至巨噬细胞后，在0h时，仅IL-4的表达水平与野毒株侵入后的表达水平差异显著；2h和4h时，6种细胞因子的表达水平均有显著的差异；8h时，IIL-4、IL-6的表达水平无差异；36h时，IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达水平无差异。为了解Asly基因的缺失对毒力因子的影响，应用本研究建立的方法对per、pmm、sodC、virB4、virB5、virB8、BvrR、BvrS和OMP259种毒力因子的转录水平进行分析，结果表明，缺失株中pmm、BvrR、omp25和BvrS四种基因的转录

6、水平降低，sodC、per、virB4、virB5和virB8的转录水平上调。对野生株和缺失株的生长特性、黏附、侵入MΦ的能力及在MΦ的增殖能力进行了比较。结果表明：S2308ΔAsly对MΦ的黏附和侵入能力无明显变化。胞内存活和增殖试验结果表明，S2308ΔAsly可以在MΦ内存活并增殖，但是增殖能力显著减弱，表明Asly影响布鲁氏菌在RAW264.7细胞内的增殖。综上所述，试验成功制备了特异性高的Asly单抗；成功构建了S2308ΔAsly缺失株；Asly基因的缺失导致细胞因子差异表达，毒力因子BvrR和BvrS呈下调表达，从而阻碍了MΦ的

7、免疫应答；S2308ΔAsly对MΦ的黏附和侵入能力无变化，胞内增殖能力却大大降低。为进一步研究Asly的功能提供参考。关键词：布鲁氏菌，Asly，单克隆抗体，荧光定量，生物学特性IIAbstractBrucellosisisaworld-widepopularzoonoticinfectiousdiseasecausedbyBrucella,whichseriouslyharmtohumanandlivestock'shealth.Becauseinvivoinducedgenesinfluencetosurvivalandpathogene

8、sisofpathogeninhost,theresearchofeffectinvivoinductedgeneinthepathogenesiso