耻垢分枝杆菌msmeg_6935基因缺失株的构建及基因缺失对生物被膜产量的影响研究

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1、耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因缺失株的构建及基因缺失对生物被膜产量的影响研究ConstructionofMSMEG_6935genedeletedMycobacteriumsmegmatisandstudyontheeffectofgenedeletiononbiofilmproduction作者姓名：金琨琪专业名称：预防兽医学指导教师：于录学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月2日基金资助:国家“十二五”重大传染病专项课题（2012ZX10003002）国家自然科学基金项目（No.311

2、72364）中文摘要耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因缺失株的构建及基因缺失对生物被膜产量的影响研究结核病是一种死亡率和感染率极高的慢性传染病，由结核分枝杆菌侵入人体引起，主要在肺部常见感染，称为肺结核。由于与艾滋病混合感染，三大传染病之一的结核病在最近几年来有卷土重来之势。自然条件下，80%以上的细菌均能形成生物被膜。生物被膜的形成加强了细菌的耐药性和对环境的耐受性，从而引起严重的持续感染。在体外条件下，结核分枝杆菌也能形成生物被膜。本课题组研究发现：在金黄色葡萄球菌中，当自溶素基因被抑制时，细

3、菌生物被膜产量会降低。结核分枝杆菌的Rv3915基因能编码cw1M蛋白，其为一种肽聚糖水解酶（自溶素的一种），它的缺失可能也会导2致生物被膜产量的降低。因此，本实验选择耻垢分枝杆菌mc155作为模拟菌，研究MSMEG_6935基因（Rv3915的同源基因）的缺失对细菌生物被膜产量的影响。之所以选择耻垢分枝杆菌作为模拟菌，是由于结核分枝杆菌的传染性和致病性，加之其生物被膜形成需要特定的条件且生长较慢；结核分枝杆菌Rv3915基因与耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因同源性高达77%，且MSMEG_69

4、35基因同样能编码肽聚糖酰胺酶（一种水解酶）。本研究首先构建了耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因缺失株和回复株。以耻2垢分枝杆菌mc155的基因组DNA和pUC4K质粒为模板，通过PCR的方法扩增出MSMEG_6935基因上下游同源臂和替换基因kan基因。在获得这三个片段后，通过融合PCR的方法将三个片段连接成一个长片段，然后将其连接到pMD18-T载体上，获得克隆载体18-T-RH。随后，再将长片段连接到温敏型穿梭载体pPR27上，构建同源重组质粒pPR27-6935。同源重组质粒pPR27-6

5、935被电转入耻垢分2枝杆菌mc155感受态中，经过抗性、温敏实验筛选得到突变株。突变株经过PCR、2序列测序以及实时定量PCR的鉴定，证明MSMEG_6935基因缺失株mc155-6935构建成功。同时，我们还构建了营救质粒pVV16-6935，通过再次同源重组获得2了MSMEG_6935基因的回复株mc155-hf-6935。22在获得MSMEG_6935基因缺失株mc155-6935和回复株mc155-hf-6935后，I我们验证了MSMEG_6935基因的缺失对耻垢分枝杆菌生物被膜产量的影响

6、。在本部分试验中，我们首先检测了基因的缺失是否对细菌生长和细菌自溶有影响。结果表明，37℃培养下，缺失株、原始株以及回复株的生长趋势基本一致，但是原始株和回复株细菌的自溶程度大于缺失株。接着我们通过试管、6孔板以及1222孔板在相同条件培养原始株mc155、缺失株mc155-6935和回复株222mc155-hf-6935，一段时间后，可以观察到mc155和mc155-hf-6935的产膜量高222于mc155-6935，而mc155与mc155-hf-6935的产膜量无明显差异。我们通过结22晶紫

7、和硝酸银染色再次证明缺失株mc155-6935产膜量低于原始株mc155和回222复株mc155-hf-6935（P<0.01），而原始株mc155和回复株mc155-hf-6935产膜量无显著差异（P>0.05）。通过实验证明，MSMEG_6935基因的缺失会使耻垢分枝杆菌的产膜量降低。本研究结果表明，MSMEG_6935基因的敲除使耻垢分枝杆菌的产膜能力下降。这将为结核分枝杆菌相关基因的研究、新药物标靶的筛选以及抗结核疫苗的研究奠定基础。关键词：耻垢分枝杆菌，MSMEG_6935，基因敲除，生物

8、被膜IIAbstractConstructionofMSMEG_6935genedeletedMycobacteriumsmegmatisandstudyontheeffectofgenedeletiononbiofilmproductionTuberculosisisachronicdiseasewhichhasahighmortalityandprevalence,itiscausedbyMycobacteriumtuberculosiswhichinvadedt