猪呼吸道疾病综合征的四种病原菌复合pcr方法建立与应用

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1、安徽农业大学硕士学位论文猪呼吸道疾病综合征的四种病原菌复合PCR方法建立与应用姓名：赵洪武申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：魏建忠201206摘要猪呼吸道疾病综合征(PorcineRespiratouDiseaseComplex，PI①C)是引起呼吸系统症状的一类重要综合征的总称，近些年来，随着规模化养殖的迅速发展，临床上出现了一种以呼吸道症状为主症的猪病，给养猪业造成巨大损失。研究表明，猪肺炎支原体(蚴旧叩加’朋口砂叩玎P甜朋D"肠P，Mhp)、猪链球菌脚fDcocc淞s”括，SS)、副猪嗜血杆菌(砌P聊印办

2、玎螂p口r傩甜西，HPS)、猪多杀性巴氏杆菌妒傩胞“坨如m础Dc矗缸，Pm)是引起PRDC常见病原菌。迄今，安徽地区猪群中Mhp、SS、HPS和Pm的流行情况还不完全清楚，同时此四种病原菌引起的临床症状较为相似，故难以从临床症状上对其诊断，不利于准确快速鉴别诊断。鉴于此，在前期研究的基础上，本研究旨在建立同步检测Mhp、ss、HPS、Pm的四重PCR方法，为临床快速鉴别鉴定及其流行病学调查研究提供技术手段。为此，本研究开展了以下两方面的工作。首先，建立了检测Mhp的单一PCR方法并优化可以同步检测Mhp、SS、HPS、P

3、m四种病原菌的复合PCR方法。根据MhpP36基因序列，应用软件设计合成特异性引物。通过优化确定了检测Mhp单一PCR方法的最佳反应体系和反应条件。再通过序列分析、敏感性试验、特异性试验和重复性试验评估建立的单一PCR方法。在单一PcR的基础上，首先寻找能检测四种病原菌的相同退火温度，然后采用正交设计优化TaqDNA聚合酶、M92+、dNTPs和引物，并对PCR发应时间和循环数进行摸索，确定了四重PCR方法的最佳反应体系和反应条件。然后，利用建立的四重PCR、单一PCR与常规细菌分离技术相结合的方法，对分别采自安徽地区临

4、床疑似PRDC发病猪、临床发病非PRDC猪以及临床假定健康猪进行检测，并进行细菌分离。结果显示，总共分离细菌27株，其中ss18株，HPS4株，Pm6株，Mhp未做分离。四重PCR方法检测结果与单～PCR方法检测结果差异不显著(P>0．05)，且符合率为91．0％。安徽各地区猪场HPS存在较高带菌情况，SS存在较高感染，唧S与SS同时阳性率较高，为15．84％(35／221)，而四种同时阳性率为O％，且病原在分布上有区域差异性，不同生长阶段的猪群均可检出。综上所述，本研究建立的四重PcR方法可以在3h鉴别出Mhp、ss、

5、HPs和Pm，且具有良好的特异性、灵敏性、稳定性和重复性，以及具有简便、快速与经济的优势，实验研究结果表明，所建立的四重PCR方法可直接用于临床PRI)C四种病原菌的鉴定，而且为安徽地区开展PRI)C流行病学调查提供了有效的技术手段。关键词：猪肺炎支原体；猪链球菌；副猪嗜血杆菌；猪多杀性巴氏杆菌；四重PCRAbstractPorcineRespirato眄DiseaseComplex(PRDC)isageneralte册ofimportantsyndromeswhichgiVeriset0therespirat0叮sym

6、ptoms．Inrecentyears，witIltherapiddeVeIopmentofla唱e-scalef．arming，aswinediseaSech甜犹terizedbyrespirat0呵symptomshasbeenarisen，causinggreatlossinswinepmduCtion．StudiesshowthatMycopldsmn时0pneumonine㈣，S舰ptococc粥s1Iis§趴，Hnemophiltlsp甜asuiS(HPS)andf切．，胞”坨肋肼甜缸Dcf如饵m)areco

7、nsideredt0bethecommonpathogensofPItDC．SincetheprevalenceofMhp，SS，HPSandPmarenotveryclearandtheabovefourpathogenshaVesimilarclinicalsymptoms，itisVeUdi伍culttodiagnose，preVent，andtreatthePRDCquicklyandaccurately．Forthisreason，thisstudyaimstoestabIishthequadruplePCRm

8、ethodwithsynchronousdctectiononMhp，SS，HPSandPmonthebasisofpreviousresearch，providingatechnicalmeansfortherapidclinicalidentificationandepidemiologicalresearch．