凋亡抑制蛋白基因dsrna转基因烟草表达载体构建

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1、凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体构建摘要：为了利用RNA干扰技术防治烟粉虱，需要构建凋亡抑制蛋白（IAP）基因dsRNA转基因烟草表达载体。利用PCR技术扩增烟粉虱IAP基因，将其连接到pMD18-T载体中，用BglII.Xhol和BamHI.SalI分别酶切，将获得的片段分别反向、正向连接至pUC-RNAi载体，用PstI酶切pUC-RNAi-IAP,回收酶切片段，将其连接到表达载体PCAMBIA-2300-35S中，并进行酶切验证。IAPdsRNA转基因烟草表达载体的成功构建为下一步转基因烟草防治烟粉虱的研究奠定基础。关键词：凋亡抑制蛋白；dsRNA；

2、转基因烟草；RNA干扰;烟粉虱中图分类号：Q782文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.01.002ConstruetionofTransgenicTobaccoPlantVectorforInhibitorofApoptosisProteinGenedsRNAGUOQiang,CHUDong,FANZhong-xue(ShandongProvincialKeyLaboratoryofEcologyandCropGeneticImprovement,Physiology,High—techResearchCenter,S

3、handongAcademyofAgriculturalSciences,Ji，nan,Shandong250100,China)PMD18-T,digestedBamHI/Sallrespectively,fragmentstopUC-RNAiPstI,andclonedwithBglll/Xholorconductedtheacquiredvector,digestedwithintothevectorAbstract：TocontolBemisiatabacibyRNAi,transgenictobaccoplantvectorforinhibitorofapo

4、ptosisprotein(IAP)genedsRNAshouldbeconstructed.Inthisstudy,weamplifiedtheIAPgeneofBemisiatabacibyPCR,inserteditintopCAMBIA—2300—35S・TransgenictobaccoplantvectorwasconfirmedbyPstIdigesting・TheconstruetionoftransgenictobaccoplantvectorforIAPdsRNAwouldlaythefoundationforthefollowingstudyof

5、pestcontrol.Keywords：inhibitorofapoptosisprotein；dsRNA；transgenictobaccoplant；RNAinterference；Bemisiatabaci烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)广泛分布于全球除南极洲外的各大洲，是热带、亚热带及相邻温带地区棉花、蔬菜和园林花卉等植物及大田作物的主要害虫之一［1］。它不仅取食寄主植物汁液，而且能够传播100多种病毒，分泌大量蜜露诱发煤污病影响光合作用［2-3］o烟粉虱也是科技界有史以来唯一被冠以"超级害虫”(superbug)的昆虫，近20年来给许

6、多国家的农业造成严重的经济损失。烟粉虱在我国广大地区已暴发成灾并造成严重危害，近年来烟粉虱传播的双生病毒在山东、浙江、江苏等地区给番茄等蔬菜造成毁灭性的危害［4］。现在控制烟粉虱的主要手段为化学防治。化学农药的大量使用，不仅导致农药残留，破坏了环境与生态系统平衡，而且导致烟粉虱抗药性逐年增强。目前，传统的烟粉虱防治策略难以满足农业生产的需要，急需新的防控手段。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)介导的特异性基因表达沉默现象,是生物的一种古老并且进化上高度保守的基因表达调节机制。Fire等［5］(1998)

7、首次发现将dsRNA注入线虫Caenorhabditiselegans可以导致同源基因的mRNA降解，从而导致转录后基因沉默，并将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象称为RNAio随后，RNAi的基础研究和应用研究迅速成为当前生命科学中的热点领域之一。例如，Zhu等[6](2008)利用RNAi技术研究几丁质酶(Chitinase)样蛋白在赤拟谷盗Triboliumcastaneum中的功能，注射TcCHT5dsRNA至幼虫，TcCHT5转录水平降低，使蛹不能完全羽化；RNAi沉默TcCHTIO表达，可以阻止胚胎孵化、幼虫蜕皮和成虫蜕变，证明