人il8正义和反义真核表达载体的构建与表达

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1、人IL8正义和反义真核表达载体的构建与表达：牛秀珑,王越,屈野,郭小芹叶路【摘要】目的:构建人IL8正义和反义真核表达载体。方法:RTPCR扩增正义和反义IL8基因片段后,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后,采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中,并用RTPCR和ELISA法检测细胞转染后IL8的表达水平。结果:经验证,重组人IL8正义/反义真核表达载体构建正确。pcDNA3.1(+)ssIL8转染A2780细胞后,其IL8mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+

2、)asIL8转染SKOV3细胞后,其IL8分泌水平降低。结论:成功构建了人IL8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)ssIL8/pcDNA3.1(+)asIL8,为后续研究IL8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础。【关键词】IL8;正义/反义;真核表达载体;卵巢癌细胞　　[Abstract]AIM:ToconstructthesenseorantisenseIL8eukaryoticexpressionvectors.METHODS:SenseorantisenseIL8fulllengthgeneplifiedbyRTPCRandcloned

3、intoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+).AftertheidentificationbyPCR,restrictionendonucleasedigestionandthenucleotidesequencing,therebinantvectorsanovariancarcinomaA2780andSKOV3celllinestransientlybylipofectaminemediation.TheexpressionofIL8geneandproteinors.　　[KeyacellsIL8是一种多功能的趋化因子,可参与多

4、种恶性肿瘤的生长、转移及血管生成。近年来研究表明[1,2],IL8在卵巢癌中高表达,其高表达可能与卵巢癌发生、发展及化疗关系密切。我们前期研究发现[3,4],IL8及雌、雄激素均可促进卵巢癌细胞增殖;IL8还可在无雌、雄激素的条件下调节卵巢癌细胞表达雌、雄激素的受体,从而增加该细胞对两种激素的敏感性。为了深入探讨IL8在卵巢癌发生、发展及化疗和内分泌治疗中的作用及作用机制,我们应用基因重组技术,成功构建人IL8正义(sense,ss)和反义(antisense,as)真核表达载体,从而为后续研究IL8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用及作用机制奠定基础。　　1材料和方法　　

5、1.1材料TOP10感受态细菌购自北京天根生物公司;真核表达载体pcDNA3.1(+)为美国Invitrogen公司产品,由本室保存。人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞均为美国ATCC公司产品,由本室保存。RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品;2×PremixTaq、MMLV逆转录酶、BamHⅠ、XhoⅠ为TaKaRa公司产品;T4DNA连接酶为美国NEB公司产品、DNA胶回收试剂盒为加拿大BioBasic公司产品;人IL8ELISA试剂盒为美国RD公司产品;OptiMEMⅠ、LipofectamineTM2000、TRIzol试剂为美国Invitroge

6、n公司产品;100bp和1kbDNAMarker、高纯度质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。　　1.2方法　　1.2.1引物设计人IL8全长编码基因扩增用引物,参照GenBank数据库(NM000584.2),采用DNAMAN软件设计,senseIL8引物,F:5′CTCGGATCCATGACTTCCAAGCTGGCCGTG3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点),R:5′AGACTCGAGTTATGAATTCTCAGCCCTCTT3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点);目的片段318bp。antisenseIL8引物,F:5′CTCGGATCCATGTGAATTCT

7、CAGCCCTCTT3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点),R:5′AGACTCGAGTTAACTTCCAAGCTGGCCGTG3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点),目的片段318bp。　　1.2.2目的基因的扩增自SKOV3细胞中提取总RNA作为逆转录模板,采用RTPCR方法扩增IL8正义全长目的基因片段。逆转录反应条件参照TaKaRaMMLV逆转录酶说明书进行,逆转录产生的cDNA经PCR扩增获得约300bp大小的目的片段(引物序列见1.2.1)。50μLIL8正义PCR产物经