人il8正义和反义真核表达载体的构建与表达的论文

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1、人IL8正义和反义真核表达载体的构建与表达的论文【摘要】目的:构建人il8正义和反义真核表达载体。方法:rtpcr扩增正义和反义il8基因片段后,将其克隆入真核表达载体pcdna3.1(+),通过菌落pcr、双酶切及测序进行鉴定后,采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系a2780和skov3细胞中,并用rtpcr和elisa法检测细胞转染后il8的表达水平。结果:经验证,重组人il8正义/反义真核表达载体构建正确。pcdna3.1(+)ssil8转染a2780细胞后,其il8mrna及蛋白表

2、达水平均显著增加;而pcdna3.1(+)asil8转染skov3细胞后,其il8分泌水平降低。结论:成功构建了人il8正义/反义真核表达质粒pcdna3.1(+)ssil8/pcdna3.1(+)asil8,为后续研究il8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础。【关键词】il8;正义/反义;真核表达载体;卵巢癌细胞constructionandexpressionofhumanil8senseorantisenseeukaryoticexpressionvectorsniuxiulong,

3、entofimmunology,medicalcollegeofchinesepeople’sarmedpoliceforces,tianjin300162,china[abstract]aim:toconstructthesenseorantisenseil8eukaryoticexpressionvectors.methods:senseorantisenseil8fulllengthgeneplifiedbyrtpcrandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpcd

4、na3.1(+).aftertheidentificationbypcr,restrictionendonucleasedigestionandthenucleotidesequencing,therebinantvectorsanovariancarcinomaa2780andskov3celllinestransientlybylipofectaminemediation.theexpressionofil8geneandproteinors.[keyacellsil8是一种多功能的趋化因子,可参与多种恶

5、性肿瘤的生长、转移及血管生成。.近年来研究表明[1,2],il8在卵巢癌中高表达,其高表达可能与卵巢癌发生、发展及化疗关系密切。我们前期研究发现[3,4],il8及雌、雄激素均可促进卵巢癌细胞增殖;il8还可在无雌、雄激素的条件下调节卵巢癌细胞表达雌、雄激素的受体,从而增加该细胞对两种激素的敏感性。为了深入探讨il8在卵巢癌发生、发展及化疗和内分泌治疗中的作用及作用机制,我们应用基因重组技术,成功构建人il8正义(sense,ss)和反义(antisense,as)真核表达载体,从而为后续研究il8在

6、卵巢癌及其他肿瘤中的作用及作用机制奠定基础。1材料和方法1.1材料top10感受态细菌购自北京天根生物公司;真核表达载体pcdna3.1(+)为美国invitrogen公司产品,由本室保存。人卵巢癌细胞系a2780和skov3细胞均为美国atcc公司产品,由本室保存。rpmi1640培养基为美国gibco公司产品;2×premixtaq、mmlv逆转录酶、bamhⅰ、xhoⅰ为takara公司产品;t4dna连接酶为美国neb公司产品、dna胶回收试剂盒为加拿大biobasic公司产品;人il8elisa试剂

7、盒为美国rd公司产品;optimemⅰ、lipofectamim2000、trizol试剂为美国invitrogen公司产品;100bp和1kbdnamarker、高纯度质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。1.2方法1.2.1引物设计人il8全长编码基因扩增用引物,参照genbank数据库(nm000584.2),采用dnaman软件设计,senseil8引物,f:5′ctcggatccatgacttccaagctggccgtg3′(划线部分为bamhⅰ酶切位点),r:5′agactcgagttat

8、gaattctcagccctctt3′(划线部分为xhoⅰ酶切位点);目的片段318bp。antisenseil8引物,f:5′ctcggatccatgtgaattctcagccctctt3′(划线部分为bamhⅰ酶切位点),r:5′agactcgagttaacttccaagctggccgtg3′(划线部分为xhoⅰ酶切位点),目的片段318bp。1.2.2目