肝癌相关抗原hab18g反义rna表达质粒的构建及克隆鉴定

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1、肝癌相关抗原HAb18G反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定摘要:目的构建HAb18G反义RNA表达质粒载体.方法用DNA重组技术将人HAb18G基因反向克隆到真核表达质粒PCI-neo中，构建成HAb18G反义RNA表达质粒PCI-asHAb18G.用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HHCC，经G418筛选后获得的克隆进行鉴定.结果HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI-asHAb18G经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.流式细胞仪及免疫组化SP法染色均证实:转染细胞HHCC/asHAb18G中HAb18G表达为阴性，而转染

2、空载体的HHCC/neu及HHCC均为强阳性.结论成功构建了HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI-asHAb18G.为进一步研究HAb18G蛋白分子的生物学功能及肝癌的基因治疗研究奠定了基础.　　Keys;geicvectors;RNA，anti-sense;HAb18G/CD147　　Abstract:AIMToconstructeukaryoticvectorexpressingantisenseRNAofHAb18G.METHODSPCI-asHAb18GacellstrainHHCCetryas-sayandindirec

3、timmunofluorescencestaining.RESULTSItmunofluorescencestainingandfluorocytometricassayshoa.　　0引言　　HAb18是我室用肝癌抗原免疫小鼠得到的特异性单克隆抗体（mAb）［1］，该mAb药物已进入Ⅱ期临床［2］.我们构建了人肝癌组织cDNA文库［3］并用HAb18mAb从其中筛选得到其相应抗原HAb18G，查询Genebank发现其基因序列与CD147分子序列一致.CD147分子，又名EMMPrin（细胞外基质金属蛋白酶诱导因子），最初源于人肺癌

4、细胞系LX-1，在肝癌组织中发现尚属首次，它具有刺激成纤维细胞产生基质金属蛋白酶（MMPs）的功能［4］.MMPs能降解细胞外基质因而在肿瘤的侵袭和转移中起到重要的作用［5］.为研究HAb18G与肝癌转移的关系，我们构建HAb18G反义RNA真核表达质粒，并观察其对人肝癌细胞HAb18G的表达的抑制作用.　　1材料和方法　　1.1材料质粒pBluescriptks（+）/HAb18G由本室构建，内含HAb18G的全长cDNA编码序列;PCI-neo真核表达质粒购自Promega公司;宿主菌大肠杆菌JM109及肝癌细胞株HHCC由本室常

5、规保存;Lipfectinamine2000脂质体转染试剂盒购自Gibco公司，质粒提取试剂盒、G418购自Promega公司，限制性内切酶，T4连接酶购自宝泰克公司;凝胶纯化试剂盒购自Clontech公司;抗人肝癌的鼠单克隆抗体HAb18由本室制备;免疫组化SP染色试剂盒购自福州迈新公司.　　1.2方法　　1.2.1DNA操作与克隆DNA操作包括感受态菌株的制备，质粒的扩增、提取，限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳分离均参照文献［6］进行，PCI-neo及pBlue-scriptks（+）/HAb18G质粒分别经XbaⅠ及XhoⅠ双酶切后进

6、行琼脂糖凝胶电泳，以凝胶纯化试剂盒纯化相应的DNA片段.用T4噬菌体DNA连接酶将1.7kb左右HAb18GcDNA全长序列反向连接到PCI-neo真核表达质粒的XhoⅠ-XbaⅠ间，构建成PCI-asHAb18G反义RNA表达载体，转化感受态细菌JM109，随机挑选氨苄抗性的转化克隆，限制性内切酶酶切鉴定.　　1.2.2插入片段部分序列的分析以T3启动子序列为测序引物，直接以构建的PCI-asHAb18G反义RNA表达载体为模板，用全自动荧光DNA序列分析仪进行单向DNA序列分析.　　1.2.3反义RNA抑制HAb18G表达用阳离子

7、脂质体Lipfectinamine2000介导将空质粒表载体PCI-neo及重组质粒PCI-asHAb18G转染至人肝癌细胞HHCC，分别命名为HHCC/neo和HHCC/asHAb18G，并以HHCC作为阴性对照.具体操作步骤参照说明书及文献［7］进行.转染第2日将细胞以1∶6的稀释比例传代培养，2d后用含400mg・LG418的选择培养液连续培养4g・L-1）下常规培养扩增.　　1.2.4转染细胞的免疫组织化学染色取经转染的细胞爬片，经冷丙酮固定，进行SP（链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶）法染色，（具体操

8、作步骤参照说明书），以抗HAb18G的mAbHAb18为一抗，生物素标记的羊抗鼠Fc段特异性IgGmAb为二抗，与链霉素抗生物素蛋白―过氧化酶及作用底物（DAB）混合进行间接免疫组织化学染色，显微镜下观察结果并照相.以空