小麦淀粉合酶基因iii片段的克隆及反义和rna干扰载体的构建

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（８）：４０～４５小麦淀粉合酶基因ＩＩＩ片段的克隆及反义和ＲＮＡ干扰载体的构建１１，２１１１２康国章官春云肖向红郭天财朱云集刘锋（１河南农业大学国家小麦工程技术研究中心郑州４５０００２２湖南农业大学农学院长沙４６１０１２）摘要采用ＲＴ?ＰＣＲ方法从小麦品种豫教２号的发育籽粒中克隆出淀粉合酶ＩＩＩ基因（ｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅＩＩＩ，ＳＳＩＩＩ）部分ｃＤＮＡ片段（５０９ｂｐ）（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＥＦ４６６００９），同源性比较结果显示，它与

2、ＧｅｎＢａｎｋ上已报道的ＳＳＩＩＩ基因有高度同源性。以ｐＷＭ１０１质粒为基础，构建了由３５Ｓ启动子调控的ＳＳＩＩＩ基因的反义表达载体ｐＷＭ１０１ＳＳＩＩＩＡ；另外，还以ｐＦＧＣ５９４１质粒为基础，构建了ＳＳＩＩＩ基因的ＲＮＡｉ干扰载体ｐＦＧＣ５９４１ＳＳＩＩＩｓａ，这些载体的构建为研究此基因的功能打下了很好的基础。关键词普通小麦淀粉合酶基因ＩＩＩ表达载体中图分类号Ｑ９４５淀粉是大多数植物（如稻麦、薯类等）种子与块茎ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＳｓ）。ＢＥ具有双重功能：一方面它能切开以的主要组成部分，在人类生活中起着举足轻重

3、的作用，α?１，４糖苷键连接的葡聚糖（包括直链淀粉或支链淀粉根据分子结构将其分为直链淀粉和支链淀粉两大类。的直链区），另一方面它又能把切下的短链通过α?１，６在小麦中，淀粉占小麦籽粒库容重７０％～８０％，其含量糖苷键连接于受体上。由于能够在葡聚糖链上引入α?的高低与组分的不同对小麦籽粒品质有很大的影１，６糖苷键，故此酶被认为影响了植物淀粉的精细结［１］构。ＤＢＥ的主要作用是特异水解淀粉中的α?１，６糖苷响。淀粉的合成主要在ＡＤＰＧ焦磷酸化酶［３］（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５′ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｌｕｃｏｓｅｐｙｒｏｐ

4、ｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，键，在淀粉合成中起最后修饰作用。ＡＧＰａｓｅ）、淀粉合酶（ｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＳ）、淀粉分支酶在淀粉合酶（ＳＳ）方面，ＧＢＳＳ主要功能是参与直链（ｓｔａｒｃｈ?ｂｒａｎｃｈｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＢＥ）和淀粉去分支酶（ｓｔａｒｃｈ淀粉的合成，它是研究最多的淀粉合酶，禾谷类的Ｗａｘｙ［４］ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＤＢＥ）等酶的催化下合成［２］，这些蛋白属于这种酶。ＳＳｓ则主要参与了支链淀粉中分酶在淀粉合成中扮演着不同角色。支链的合成，它有许多同工酶。如玉米的ＳＳｓ分为ＡＧ

5、Ｐａｓｅ的作用是把来自光合作用的葡萄糖?１?磷ｚＳＳＩ、ｚＳＳＩＩａ和ｚＳＳＩＩｂ，马铃薯的ＳＳｓ也至少有ＳＩ、ＳＳＩＩ和［５］ＳＳＩＩＩ３种。每一种可溶性ＳＳｓ在支链淀粉的合成中酸（Ｇ?１?Ｐ）和ＡＴＰ转变成ＡＤＰ葡萄糖（ＡＤＰ?ｇｌｕｃｏｓｅ，也发挥着不同作用。玉米的ＳＳＩ与ＤＰ（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ＡＤＰ?Ｇｌｃ）和ＡＤＰ，其中ＡＤＰ?Ｇｌｃ是合成淀粉的底物，因葡糖聚体）６?１５的短链合成有关，ＳＳＩＩａ参与了ＤＰ＞２４此，ＡＧＰａｓｅ被认为是合成淀粉的限速酶。ＳＳ是以寡聚的长链合成；马铃薯的ＳＳＩ

6、Ｉ在中等长度的支链淀粉合糖为前体，ＡＤＰ?Ｇｌｃ作底物，通过α?１，４键连接，把ＡＤＰ成中发挥着重要作用，而ＳＳＩＩＩ则主要催化了ＤＰ２５?３５?Ｇｌｃ上的Ｇｌｃ连到寡聚糖上，形成直链淀粉或分支淀粉［６］的长链合成。的延伸分支链。根据在提取液中与淀粉粒的结合程但有关小麦中三种类型ＳＳｓ各自的功能研究尚未度，ＳＳ分为颗粒结合淀粉合酶（ｇｒａｎｕｌｅｂｏｕｎｄｓｔａｒｃｈ见报道。为此，我们从小麦籽粒中克隆出了ＳＳＩＩＩ基因ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＧＢＳＳ）与可溶性淀粉合酶（ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈ的ｃＤＮＡ部分片段，由于反

7、义ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ，收稿日期：２００７０３２７修回日期：２００７０５２２ａｓＲＮＡ）技术和近年来新发展的ＲＮＡｉ干扰技术提供了中国博士后科学基金（第三十九批），河南省教育厅自然科学基金（２００６２１０００７）共同资助项目人为控制基因表达的有效方法，现已成为基因工程研通讯作者，电子信箱：ｇｃｙｕｎ＠１６３．ｃｏｍ究中的重要手段，基于此，我们把克隆出的ＳＳＩＩＩ基因２００７，２７（８）康国章等：小麦淀粉合酶基因ＩＩＩ片段的克隆及反义和ＲＮＡ干扰载体的构建４１片段构建了反义表达载体和ＲＮＡｉ

8、干扰载体，这为研究ＲＴａｓｅｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ实验操作步骤进行。将离心ＳＳＩＩＩ在小麦淀粉合成中的功能打下了很好的基础。管置于冰上，加入１μｇ总ＲＮＡ、２μｌＯｌｉｇｏｄ（Ｔ）１８（１０μｍｏｌ／Ｌ）和９μｌＤＥＰＣＨＯ，７０℃５ｍｉｎ，轻离心，加２１材料与方法入４μｌ反应缓冲液（５×）、２μｌｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）和１．１材料与试剂１