端粒酶htert基因反义rna表达载体构建及其对肝癌细胞smmc-7721作用

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1、摘要端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA-蛋白质结构具有维持染色体的结构稳定和生物功能的作用.随着细胞分裂端粒每次缩短30200bp当端粒缩短到某临界长度时细胞则发生衰老或凋亡而许多肿瘤细胞由于某种机制的作用激活了端粒酶从而使端粒维持在一定长度使癌细胞能够持续繁殖端粒酶是一种核糖蛋白酶端粒酶催化亚基具有逆转录酶活性能以自身RNA为模板向染色体末端添加端粒序列弥补端粒的丢失阻止端粒缩短据统计大部分恶化肿瘤中端粒酶检测为阳性,由于端粒酶活性和肿瘤细胞的生存与转化间存在如此高的相关性人们认为两者之间必然有某种联系端粒酶激活可能是细胞癌变或永生化的一个必然通路因此抑制端粒酶活性可作

2、为肿瘤基因治疗的一个理想的新靶点本文以分子克隆技术成功构建人端粒逆转录酶(hTERT)基因反义RNA表达载体研究其对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响采用聚合酶链反应PCR扩增hTERT基因片段经测序证实后反向插入到表达载体pcDNA3.1/myc-His中成功构建hTERT基因反义表达载体pcDNA3.1-hTERT(as)经脂质体介导转染人肝癌细胞株SMMC-7721,通过新霉素类似物(G418)筛选获得表达端粒酶hTERT基因反义RNA的稳定细胞株采用噻唑蓝MTT法端粒重复序列扩增-酶连免疫吸附检测法TRAP-ELISA流式细胞术和荧光定量PCR仪分别观察细胞的增殖端粒

3、酶的活性和细胞凋亡及细胞hTERT基因mRNA的水平结果发现1.通过细胞生长曲线的绘制和MTT法研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响结果表明与对照组细胞相比hTERT基因反义RNA能明显抑制肝癌细胞生长2.通过TRAP-ELISA法研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌细胞端粒酶活性的影响hTERT反义RNA转入肝癌细胞SMMC-7721后与对照组相比细胞端粒酶活性明显降低3.通过流式细胞仪研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌细胞的凋亡和细I胞周期的影响转染hTERT反义RNA的SMMC-7721肝癌细胞在培养一段时间后出现DNA亚二倍

4、体凋亡峰凋亡率为13.77%,明显高于SMMC-7721肝癌细胞的3.29%和转染空载体pcDNA3.1的SMMC-7721肝癌细胞的3.37%凋亡率显著提高与对照组相比转染hTERT反义RNA的SMMC-7721肝癌细胞的细胞周期发生明显变化其S期细胞数量明显增加G0/G1期细胞数量明显减少4.通过荧光定量PCR仪研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌细胞的hTERTmRNA水平的影响与对照组相比转染细胞的hTERTmRNA的水平无变化本研究表明hTERT基因反义RNA可有效抑制肝癌细胞生长和诱导细胞凋亡为反义RNA治疗肝癌提供了实验基础为肝癌的基因治疗提供了一种新的方法关

5、键词端粒端粒酶反义RNA肝癌细胞IIAbstractTelomeresarespecializedribonucleoproteinstructuresattheendsofeukaryoticlinearchromosomes.Theyarecomposedofrepetitivenucleotidesequencesandassociatedproteinsthatprotectchromosomesfromdegradationandrecombination.Theyareessentialforchromosomestability.Inhumansomaticcel

6、ls,telomeresshortenby30to200bpwitheachcelldivision.Whentelomereswereshortenedtosomethresholdvalue,cellsenescenceorapoptosiswastriggered.Themechanismisthattelomeraseisactivatedsothattelomeresaremaintainedatacertainlengthintumors,keepingcellgrowing.Telomeraseisaribonucleoproteincomplexthatadds

7、TTAGGGrepeatsontothe3'endsofchromosomalDNAtermini,therebycompensatingforincompletereplication.Humantelomerasereversetranscripase(hTERT)isakeycomponentoftelomerasecatalyticactivity.Hightelomeraseactivityhasbeendemonstratedin85to90ofallhumantumorsacc