sirna稳定抑制肝癌细胞htert基因的表达

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1、SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达【关键词】肝肿瘤StableinhibitionofhTERTgenebysiRNAinhepatocarcinomacells　　【Abstract】AIM:ToelucidatethetimeefficiencyrelationofstableinhibitionofhepatocarcinomacellproliferationbyRNAinterferenceinvitro.METHODS:ThestablescreeninginhibitiontechniqueofRNAiallhairpinRNA

2、(shRNA)targetinghTERTgeneaSMMC7721cells,acelllinesstablelyexpressingpGenesilshRNAhTERT.RealtimeRTPCR,MTTandPCRTRAPRNAexpressions,telomeraseactivityandcellproliferation.RESULTS:TheeffectivenessofRNAiexistedcontinuallyandstablyinhepatocarcinomaSMMC7721cellsexpressingstablypGenesils

3、hRNAhTERT.InthecelllinesexpressingstablypGenesilshRNAhTERT,hTERTmRNAeraseactivitiesaSMMC7721cellproliferationsignificantlyinhibitedinpGenesilshRNAhTERTgroupparedtothatinnegativecontrolgroup.CONCLUSION:RNAimaycontinuallyandstablysuppresshTERTmRNAexpressionandcarcinomacellprolifera

4、tion,orgenetherapy.　　【Keys;telomerase　　【摘要】目的：利用RNA干扰稳定筛选抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达，探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时效关系.方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA，构建重组表达质粒pGenesilshRNAhTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株，经G418筛选，建立稳定表达siRNAhTERT的细胞株.采用realtimeRTPCR、MTT和PCRTRAP法同时检测pGenesilshRNAhTERT稳定抑制组和未处理SMMC7721细胞组hT

5、ERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化.结果：在稳定表达pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低，瘤细胞增殖被抑制.结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERTmRNA表达及肿瘤细胞增殖，是有潜力的基因治疗肿瘤新方法.　　【关键词】RNA干扰；肝肿瘤；端粒，末端转移酶　　0引言　　端粒酶的异常表达与恶性肿瘤的发生发展和预后密切相关〔1〕，hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89.5%〔2〕.研究表明hTERT的高表达能通过多分化刺激来抑制细胞凋亡，导致细

6、胞永生化〔3〕.我们依据RNA干扰（RNAinterference,RNAi）原理，使用短发夹样RNA（smallhairpinRNA,shRNA）设计的RNAiDNA载体方法〔4〕，以hTERT基因为靶点，构建稳定表达小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)的肝癌SMMC7721细胞株，从体外研究siRNA稳定、特异诱导hTERT基因转录后沉默，逆转癌细胞恶性表型的能力，探讨RNAi基因治疗恶性肿瘤的时效性.　　1材料和方法　　1.1材料　　肝癌SMMC7721细胞株购自上海细胞生物研究所.质粒pGenesil1购自武汉晶赛生

7、物工程技术有限公司.限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自Roche公司,总RNA提取试剂、转染试剂LipofectamineTM2000等分别购自Takara和Invitrogen公司；端粒酶TRAPHybKit购自华美生物工程公司.Taqman探针和引物由Takara公司合成，hTERT及内参PO的探针和引物序列参照文献〔4〕.siRNAhTERT转录模板由上海博亚公司合成.　　1.2方法　　shRNA发夹结构序列长度为69bp，两端分别为BamHⅠ,HindⅢ酶切位点，中间为9bp茎环序列分隔的反向重复靶序列，并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止

8、子.质粒构建采用BamHⅠ,HindⅢ双酶切空质粒pGenesil1，将shRN