sirna表达载体对mcf-7细胞生长及其htert蛋白表达抑制的研究

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1、英文缩写PTGS英汉缩略名词对照表英文全称中文译名post-transcriptionalgenesilencing转录后基因表达沉默现象SDS-PAGESDSpolyacrylamidegel，electrophoresis聚丙烯酰氨凝胶电泳4ⅣD溺bpDMSOEGFPhTERTh豫TPlKanarmRNARNARN触shRNAsiRNAdsRNArpmanalysisofvariancebasepair方差分析碱基对Dimethylsulphoxide二甲基亚砜enhancementgreenfluorescentprotein增强

2、型绿色荧光蛋白humantelomerasereversetranscriptase人端粒酶逆转录酶humantelomeraseRNAtelomeraseprotein1KanamycinmessageribonucleicacidribonucleicacidRNAinterferencesmallhairpinRNAsmallinterferenceRNAdouble-strandedRNA，dsRNAratesperminute．39．人端粒酶RNA端粒酶相关蛋白1卡那霉素信使核糖核酸核糖核酸RNA干扰短发夹RNA／I、千扰RN

3、A'●W⋯’一一双链RNA每分钟转速泸州医学院硕士研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：辩醐：7"州日泸州医学院学位论文版权使用授权书本人完全了解泸州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：泸州医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权泸州医学

4、院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文，即：泸州医学院具有学位论文的数字化制品复制权，信息网络传播权和汇编权。保密的学位论文在解密后适用本授权书。El一=易日签字日期勿b7午厂月方纱日siRNA表达载体对MCF．7细胞生长及其hTERT蛋白表达抑制的研究摘要目的：构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体，探讨该表达载体对人乳腺癌细胞系MCF．7细胞生长及其hTERT蛋白表达的特异性抑制作用。方法：设计针对hTER

5、T基因的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA，合成具有该靶序列短发夹结构的两条寡核苷酸，其排列顺序为BamHI酶切位点、19nt正义序列、9ntloop序列、19nt反义序列、RNA聚合酶ⅡI终止子(6个T)、SalI酶切位点、HindIII酶切位点。合成后退火形成双链DNA。将pGenesil．1表达载体BamHI、HindlII双酶切后电泳分离，纯化回收4800bp左右的大片段。退火形成的双链DNA通过T4DNA连接酶连接到线性化pGenesil．1质粒U6启动子下游，构建重组siRNA表达质粒pGenesil．hTER

6、T。再将重组质粒转化用CaCl2法制备的感受态细胞DH5a，经Kana‘抗性筛选，挑选阳性克隆菌落摇菌扩增，并抽提纯化质粒，将抽提的重组质粒分别做PstI和SalI单酶切和琼脂糖电泳分析，同时做测序鉴定以确定插入的干扰片段准确无误，即针对hTERT基因的siRNA表达载体构建成功。同时完成不针对任何基因的阴性对照重组质粒的构建。培养MCF．7细胞，待细胞生长状态良好并达到指数生长期时，于转染前一日接种于4个96孔板，每板设置空白组、脂质体组、阴性对照组及pGenesil．hTERT组。以每孔O．15“g重组质粒、0．375山Lipofe

7、ctamineTM2000脂质体配成转染复合物，加入各孔MCF．7细胞中进行转染(脂质体组用无菌水代替质粒，空白组不加任何试剂)，分别于转染后24h、36h、48h、72h用MTT法检测细胞增殖情况；之后将指数生长期细胞接种于6孔板，组别设置同前，以每孔3弘g重组质粒、7．5出脂质体配成转染复合物，加入各孔MCF．7细胞中进行转染，转染后48h重组质粒上带有的EGFP基因得以表达，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞所占比例，。以此来判断转染效率。接着裂解各组细胞提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。以各组总蛋白为模板，B．肌动蛋白(B．actin

8、)为内对照进行SDS．PAGE电泳，半干法转膜，一抗、二抗杂交孵育，最后化学发光液显影并用紫外凝胶成像分析系统自动曝光。结果用凝胶成像仪扫描QuantityOne4．4．0软件分析，检测各组hTERT蛋白的