sirna稳定抑制肝癌细胞htert基因的表达论文

《sirna稳定抑制肝癌细胞htert基因的表达论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达论文【关键词】肝肿瘤StableinhibitionofhTERTgenebysiRNAinhepatocarcinomacells【Abstract】AIM:ToelucidatethetimeefficiencyrelationofstableinhibitionofhepatocarcinomacellproliferationbyRNAinterferenceinvitro.METHODS:ThestablescreeninginhibitiontechniqueofRNAiallh

2、airpinRNA(shRNA)targetinghTERTgeneaSMMC7721cells,acelllinesstablelyexpressingpGenesilshRNAhTERT.RealtimeRTPCR,MTTandPCRTRAPRNAexpressions,telomeraseactivityandcellproliferation.RESULTS:TheeffectivenessofRNAiexistedcontinuallyandstablyinhepatocarcinomaSMMC7721cellsexpress

3、ingstablypGenesilshRNAhTERT.InthecelllinesexpressingstablypGenesilshRNAhTERT,hTERTmRNAeraseactivitiesaSMMC7721cellproliferationsignificantlyinhibitedinpGenesilshRNAhTERTgroupparedtothatinnegativecontrolgroup.CONCLUSION:RNAimaycontinuallyandstablysuppresshTERTmRNAexpressi

4、onandcarcinomacellproliferation,orgenetherapy.【Keys;telomerase【摘要】目的：利用RNA干扰稳定筛选抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达，探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时效关系.方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA，构建重组表达质粒pGenesilshRNAhTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株，经G418筛选，建立稳定表达siRNAhTERT的细胞株.采用realtimeRTPCR、MTT和PCRTRAP法同时检测pGenesil

5、shRNAhTERT稳定抑制组和未处理SMMC7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化.结果：在稳定表达pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低.freelRNA表达及肿瘤细胞增殖，是有潜力的基因治疗肿瘤新方法.【关键词】RNA干扰；肝肿瘤；端粒，末端转移酶0引言端粒酶的异常表达与恶性肿瘤的发生发展和预后密切相关［1］，hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89.5%［2］.研究表明hTERT的高表达能通过多分化刺激来抑制细胞凋

6、亡，导致细胞永生化［3］.我们依据RNA干扰（RNAinterference,RNAi）原理，使用短发夹样RNA（smallhairpinRNA,shRNA）设计的RNAiDNA载体方法［4］，以hTERT基因为靶点，构建稳定表达小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)的肝癌SMMC7721细胞株，从体外研究siRNA稳定、特异诱导hTERT基因转录后沉默，逆转癌细胞恶性表型的能力，探讨RNAi基因治疗恶性肿瘤的时效性.1材料和方法1.1材料肝癌SMMC7721细胞株购自上海细胞生物研究所.质粒pGenesil

7、1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司.限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自Roche公司,总RNA提取试剂、转染试剂LipofectamineTM2000等分别购自Takara和Invitrogen公司；端粒酶TRAPHybKit购自华美生物工程公司.Taqman探针和引物由Takara公司合成，hTERT及内参PO的探针和引物序列参照文献［4］.siRNAhTERT转录模板由上海博亚公司合成.1.2方法shRNA发夹结构序列长度为69bp，两端分别为BamHⅠ,HindⅢ酶切位点，中间为9bp茎环序列分隔的反向重复靶序列，并以6个T作

8、为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子.质粒构建采用BamHⅠ,.freelineTM2000脂质体转染法.操作按说明书进行，质粒∶脂质体=1∶3.2RNA表达实时PCR反应体系25μL，内含5×realtimePC