针对s基因的sirna抑制hepg2+2215细胞中hbv基因的表达

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1、428以科学发展观促进科技创新(下)作者简介王以光，中国医学科学院医药生物技术研究所微生物代谢工程研究室主任，教授，博士生导师。北京生物工程学会理事，中国生物工程学会会员[E44000435S(z)]，中国药学会高级会员(000204)。电话：01063038137，传真：01063176489；E—mail：wangyh456@yahoo．com．cn。针对S基因的siRNA抑制HepG22．2．15细胞中HBV基因的表达杨安钢刘家云第四军医大学基础部免疫学教研室，西安，710032摘要构建针对乙型肝炎病毒．(HBV)S基因的siRNA表达载体，观察其对HBV基因表达的影响。结果显示si

2、RNA能明显抑制HepG22．2．15细胞HBsAg和HBeAg的分泌，并显著降低HBVmRNA的表达。表明栽体产生的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达。关键词基因治疗乙型肝炎病毒RNA干涉转染由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)持续感染所引起的病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等已成为严重危害我国人民生命健康的疾病，迄今尚无有效的抗病毒治疗手段。RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是双链RNA(double—strandRNA，dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默(posttran．scriptionalgenesilencing，PT

3、GS)现象，广泛存在子多种生物体中，具有高效性和特异性。目前，RNAi已发展成为一种高效的实验技术，广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定以及基因治疗等方面，显示了广阔的应用前景。为探索RNAi对HBV的复制是否具有稳定、高效、特异性抑制作用，我们选择HBV表面抗原编码区(S区)基因为靶序列，构建了含有能产生发夹结构的小干涉RNA(shortinterferingRNA，siRNA)的载体pSUPER—S1和pSUPER—S2，并分别与pTK—Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG22．2．15细胞，经潮霉素抗性筛选获得稳定细胞克隆，对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测，用RT

4、—PCR检测其对靶基因tuRNA的抑制效果。一、材料与方法(一)质粒、细胞和引物含H1启动子的siRNA表达载体pSUPER和潮霉索抗性质粒pTK～Hyg均为第四军医大学免疫学教研室保存。稳定表达HBV的HepG22．2．15细胞系由第四军医大学病原生物学教研室提供，在含10％胎牛血清(Invitrogen公司)和200t-tg／mLG418的DMEM培养基中，37℃，5％CO：培养。用于扩增HBVS区序列的上游引物caacttgtcctggttatcgc，下游序列aagccctacgaaccactgaa；用于扩增内参照3一磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydephosphated

5、ehydrogenase，GAPDH)基因的上游引物序列caacggattt．ggtcgtattggg，下游引物序列cctggaagatggtgatgggatt，上述引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。(二)主要试剂T4DNA连接酶、T4多聚核苷酸激酶(PNK)和各种限制性内切酶均为大连宝生物公司产品，胎牛第21分会场生物技术产业化429=======#===============‘===================z=====2====2z一血清、DMEM培养基和脂质体转染试剂Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司，G418为Sigma产品，潮霉素购

6、于Roche公司。鼠抗HBs、兔抗HBc和SABC—Cy3免疫荧光检测试剂盒购于武汉博士德公司。(三)HBVS基因siRNA表达载体的构建根据siRNA的设计原则，从HBVS基因编码区中寻找符合设计特征的靶序列，经BLAST软件进行同源分析证实为HBV保守序列后，选择HBV编码区413—431、671—689核菅酸序列为S基因干涉位点。HBV—S1序列tcctgctgctatgcctcat，HBV—S2序列ggctcagtttactagtgcc；此外还设计了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA表达载体pSUPER—EGFP为对照，其序列ggacgacggcaactacaag。合成的编

7、码siRNA的单链寡核苷酸经退火、磷酸化，克隆入pSUPER载体，EcoRI和HindⅢ酶切鉴定，阳性克隆切出大约300bp的条带，而空质粒的大小为240bp，筛选出含HBV基因的阳性克隆，并进行DNA测序加以确定。(四)细胞转染及单克隆细胞株的筛选HepG22．2．15细胞生长于含10％胎牛血清、200t-g／mlG418的DMEM培养基中，接种于6孔板，24h后分别以pSUPER—S1、pSUPER—S2、pSUPE