针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用

针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用

ID:25547841

大小:53.50 KB

页数:6页

时间:2018-11-21

针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用_第1页
针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用_第2页
针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用_第3页
针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用_第4页
针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用_第5页
资源描述:

《针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库

1、针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用作者:秦炜炜,刘家云,张瑞,王涛,王凯,孟艳玲,杨安钢【关键词】乙型肝炎病毒;,RNA干扰;,腺病毒;,基因治疗  PreparationofrebinantadenovirusmediatedsiRNAtargetingHBVxgeneanditssuppressiveeffectonHBVxgeneexpression  【Abstract】AIM:Toconstructtherebinantadenovirusvector

2、sforsiRNAtargetingHBVxgene(HBx)andtoevaluatetheinhibitiveeffectontheexpressionofHBxgeneinhumanhepatomaHepG2cellline.METHODS:TheshuttlevectorpShuttleHBxid.Thehomologousrebinantsplified,folloinedbyRTPCRand2000,RTPCR试剂盒和TRIZOLTM试剂(Invitrogen公司);myc标签,EGFP多克

3、隆抗体(SantaCruz公司);兔抗人βactin多克隆抗体和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(武汉博士德公司);ECL化学发光试剂盒为(Pierce公司).用于扩增HBx基因的上游引物:5′TTTAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCC3′,下游引物:5′TTTGGTACCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3′;用于扩增内参照βactin基因的上游引物:5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′,下游引物:5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′

4、;用于扩增EGFP基因的上游引物:5′ATGCCAGCGGGGACAGCAGC3′,下游引物:5′GGTGTCTCCTGGTCTCTTCC3′,上述引物由北京三博远志生物技术有限公司合成.  1.2方法  1.2.1pShuttleHBx2,pShuttleHBx5载体的构建  经XbaI和HindIII双酶切反应,从pSUPERHBx2,pSUPERHBx5质粒获取RNAi表达框片断HBx2和HBx5(大小300bp左右),将两目的片断回收后亚克隆入同样经XbaI和HindIII双酶切的腺病毒穿梭质粒

5、pShuttle,卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用XbaI和HindIII双酶切,10mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.获得含小干扰RNA(shortinterferingRNA,siRNA)表达框的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.  1.2.2pAdeasyHBx2,pAdeasyHBx5载体的构建  将pShuttleHBx2,pShuttleHBx5质粒用PmeI酶切线性化,与pAdeasy1按10∶1的比例电转化至BJ5183感受态细菌.卡那霉素选择性培

6、养基筛选阳性克隆,挑取较小的克隆扩增培养,提取质粒.用PmeI酶切鉴定质粒,将鉴定正确的重组质粒再次转化DH5α感受态细胞,扩增阳性克隆并大量提取质粒,得到含针对HBx干涉表达框的重组腺病毒质粒.(阴性对照质粒AdeasyH1为带有H1启动子的pAdShuttle质粒,用PmeI酶切线性化后与pAdeasy同源重组得到).  1.2.3重组腺病毒的包装与病毒滴度测定  ①包装细胞培养:含100mL/L胎牛血清的HDMEM培养基,37℃,50mL/LCO2培养箱中培养HEK293细胞,当细胞汇合度达70%

7、~80%时转染.②重组腺病毒质粒转染HEK293细胞:重组质粒pAdeasyHBx2,pAdeasyHBx5用PacI酶切线性化后回收,按照LipofectAmineTM2000说明书转染6孔培养板中的HEK293细胞,37℃,50mL/LCO2培养箱中孵育,10~12d后收集细胞,液氮与37℃两个温度下反复冻融4次,裂解细胞以收获原始病毒,病毒感染HEK293细胞使病毒大量扩增.重复上述步骤,最终收集3轮扩增的病毒液,分装保存于-70℃.③病毒滴度的测定:用TCID法检测病毒滴度后,得到1×1010p

8、fu/mL的病毒工作液.  1.2.4RTPCR检测  重组腺病毒对HBx基因mRNA的降解作用制备的重组腺病毒感染人肝癌细胞株HepG2,同时转染表达HBx基因的质粒pDA3.1HBxmyc和pCDNA3EGFP,后者用来监测各组转染效率,对照组转染只含有H1启动子的质粒AdeasyH1.37℃,50mL/LCO2培养箱中孵育,48h后,分别收集细胞总RNA和蛋白.通过RTPCR检测HepG2细胞HBx转录水平的变化:提取实验组和对照组H

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。