针对hbvx基因的sirna重组腺病毒的制备及其对hbvx基因表达的抑制作用论文

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1、针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用论文秦炜炜，刘家云，张瑞，王涛，王凯，孟艳玲，杨安钢【关键词】乙型肝炎病毒；,RNA干扰；,腺病毒；,基因治疗PreparationofrebinantadenovirusmediatedsiRNAtargetingHBVxgeneanditssuppressiveeffectonHBVxgeneexpression【Abstract】AIM:ToconstructtherebinantadenovirusvectorsforsiRNAtargetingHBVxgene（HBx）andtoevaluatetheinh

2、ibitiveeffectontheexpressionofHBxgeneinhumanhepatomaHepG2cellline.METHODS:TheshuttlevectorpShuttleHBxid.Thehomologousrebinantsplified,folloinedbyRTPCRand2000，RTPCR试剂盒和TRIZOLTM试剂（Invitrogen公司）；myc标签,EGFP多克隆抗体（SantaCruz公司）；兔抗人βactin多克隆抗体和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗（武汉博士德公司）；ECL化学发光试剂盒为（Pierce公司）.用于扩增HBx基因的上游引物

3、：5′TTTAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCC3′，下游引物：5′TTTGGTACCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3′；用于扩增内参照βactin基因的上游引物:5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′,下游引物:5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′；用于扩增EGFP基因的上游引物：5′ATGCCAGCGGGGACAGCAGC3′，下游引物：5′GGTGTCTCCTGGTCTCTTCC3′,上述引物由北京三博远志生物技术有限公司合成.1.2方法1.2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5载体的构建经XbaI和

4、HindIII双酶切反应，从pSUPERHBx2，pSUPERHBx5质粒获取RNAi表达框片断HBx2和HBx5（大小300bp左右），将两目的片断回收后亚克隆入同样经XbaI和HindIII双酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用XbaI和HindIII双酶切，10mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.获得含小干扰RNA(shortinterferingRNA,.freeleI酶切线性化，与pAdeasy1按10∶1的比例电转化至BJ5183感受态细菌.卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取较小的克隆扩增培养，提取质粒.用PmeI酶切鉴定质粒，将鉴定正

5、确的重组质粒再次转化DH5α感受态细胞，扩增阳性克隆并大量提取质粒，得到含针对HBx干涉表达框的重组腺病毒质粒.（阴性对照质粒AdeasyH1为带有H1启动子的pAdShuttle质粒，用PmeI酶切线性化后与pAdeasy同源重组得到）.1.2.3重组腺病毒的包装与病毒滴度测定①包装细胞培养：含100mL/L胎牛血清的HDMEM培养基，37℃，50mL/LCO2培养箱中培养HEK293细胞，当细胞汇合度达70%~80%时转染.②重组腺病毒质粒转染HEK293细胞：重组质粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用PacI酶切线性化后回收，按照LipofectAmineTM2000说明

6、书转染6孔培养板中的HEK293细胞，37℃，50mL/LCO2培养箱中孵育，10~12d后收集细胞，液氮与37℃两个温度下反复冻融4次，裂解细胞以收获原始病毒，病毒感染HEK293细胞使病毒大量扩增.重复上述步骤，最终收集3轮扩增的病毒液，分装保存于-70℃.③病毒滴度的测定：用TCID法检测病毒滴度后，得到1×1010pfu/mL的病毒工作液.1.2.4RTPCR检测重组腺病毒对HBx基因mRNA的降解作用制备的重组腺病毒感染人肝癌细胞株HepG2，同时转染表达HBx基因的质粒pDA3.1HBxmyc和pCDNA3EGFP，后者用来监测各组转染效率，对照组转染只含有H1启动子的质粒Ade

7、asyH1.37℃，50mL/LCO2培养箱中孵育，48h后，分别收集细胞总RNA和蛋白.通过RTPCR检测HepG2细胞HBx转录水平的变化：提取实验组和对照组HepG2细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，取5μg总RNA按照SuperScriptTMⅡ说明书进行cDNA第一链的合成，以反转录得到的cDNA为模板在PE2400型DNA扩增仪上进行PCR反应.HBxPCR条件为：95℃变性5min，