hbvx基因对成人肝细胞hl7702线粒体功能的影响

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1、HBVX基因对成人肝细胞HL7702线粒体功能的影响：林纳,李丹,陈红英,陈治新,王小众【摘要】目的:研究HBVX基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。方法:将HBVX基因真核表达载体pCDNA3X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL7702细胞,经过2周G418筛选,获得稳定表达的新细胞株,分别命名为HL7702/HBx和H7702/pcDNA3,RTPCR和:TostudytheeffectofHBxonaneitochondria.METHODS:ArebinanteukaryoticexpressionplasmidpcDNA3XedHL

2、7702/HBxandHL7702/pcDNA3.TheexpressionofCOXⅢinHL7702/HBx,HL7702/pcDNA3andHL7702cellsecoxidaseactivitiesofthreegroupsetricallyat550nmbyusingpartiallypurifiedmitochondria.RESULTS:COXⅢmRNAexpressiondidn’tchange,ecoxidaseactivityuchloitochondrialcytochromecoxidaseactivity.［Keyecoxidase［摘要］目的

3、:研究HBVX基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。方法:将HBVX基因真核表达载体pCDNA3X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL7702细胞,经过2周G418筛选,获得稳定表达的新细胞株,分别命名为HL7702/HBx和H7702/pcDNA3,RTPCR和r)约为16500。X基因及其产物HBx在肝炎病毒慢性感染过程中直接或间接促进HCC的发生、发展。目前,HBx的亚细胞定位尚存在争议。Henkler等［1］发现X蛋白在低表达的细胞中完全或绝大部分定位于细胞核内,而过量表达的X蛋白则分布于胞质中。另有学者观察到HBx在细胞质内的水平高于细胞核

4、,且细胞质中的HBx主要分布于线粒体外膜上［2］。目前已证实HBx并不直接作用于双链DNA,主要通过与细胞内多种蛋白质相互作用影响细胞的生物学功能,故研究体内X结合蛋白对阐明X蛋白的作用及机制有重要作用。我们前期研究已经通过酵母双杂交体系从成人正常肝细胞cDNA文库中筛选出一种新的X结合蛋白细胞色素c氧化酶Ⅲ（cytochromecoxidaseⅢ,COXⅢ）［3］。细胞色素c氧化酶复合体是最具特征的呼吸链酶复合体,由13个亚基组成,COXⅢ在复合酶的聚集和稳定性中起重要作用,并参与质子的传递和细胞色素c氧化酶介导的能量转换［4］。我们以成人肝细胞HL7702为研究对象的,通过

5、构建HBVX基因真核表达载体pcDNA3X,并将其稳定转染给HL7702细胞,检测HBx与COXⅢ的相互作用以及由此引起的线粒体结构和功能变化,进一步阐明HBV的致癌机制。1材料和方法1.1材料质粒抽提试剂盒购自深圳生物晶美公司、pcDNA3表达载体购自Invitrogen公司;重组HBVX基因真核表达载体pcDNA3X由本实验室保存。成人肝细胞株HL7702购自中科院上海细胞库,DMEM、F12和胰蛋白酶购自Invitrogen公司。TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司;逆转录试剂盒,JetPEITMGal转染试剂盒购自法国Polyplustransfecti

6、on公司,TRIzol试剂购自Invitrogen公司;线粒体抽提试剂盒购自Piecer公司;线粒体细胞色素氧化酶活性检测试剂盒购自美国Sigma公司。小鼠抗人乙肝病毒X蛋白购自Chemicon公司,山羊抗人COXⅢ多克隆抗体、小鼠抗人βactin单克隆抗体（mAb）购自美国SantaCruz公司,兔抗小鼠二抗、马抗山羊二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司,EM∶F12=3∶1）培养液中,采用JetPEITMGal转染试剂盒将质粒pcDNA3和重组真核表达载体pcDNA3X转入HL7702肝细胞株中,命名为HL7702/pcDNA3、HL7702/HBx,步骤如下:选

7、取对数生长期细胞,消化接种于25cm培养瓶,细胞数为1×106/L,待细胞贴壁后,即可进行转染。取2支无菌试管,分别加入5μgDNA和16μLJetPEI,以250μLNaCl（150mmoL/L）稀释,轻轻涡旋,将JetPEI加入DNA中,轻轻混匀,室温孵育30min。将细胞内培养液倒去,加入新鲜培养液及500μLDNA/JetPEI混合液,轻轻摇匀,继续培养48h。转染结束后将细胞消化移入6孔板,加入终浓度为800μg/LG418进行筛选,2周后分别获得单克隆细胞1株,