难转染悬浮细胞OCI—LY8慢病毒过表达稳定细胞株的构建-论文.pdf

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1、广东医学2014年5月第35卷第9期GuangdongMedicalJournalMay．2014，Vo1．35，No．9·1323·难转染悬浮细胞OCI—LY8慢病毒过表达稳定细胞株的构建米黄会杰，葛岩，罗国兰，徐方平，许洁，陈洁，张科平，刘艳辉广东省人民医院(广东省医学科学院)病理医学部病理科(广州510080)【摘要】目的探讨难转染悬浮细胞慢病毒过表达稳定细胞株的构建方法。方法选用人弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株OCI—LY8为研究对象，分别用Fbw7基因的慢病毒原液、慢病毒浓缩液、慢病毒浓缩液加入终浓度为5g／mL的1，5一

2、二甲基一1，5一二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、慢病毒浓缩液加入终浓度为l0mL的polybrene4种方式进行感染。因慢病毒载体含有绿色荧光蛋白报告基因，故通过倒置荧光显微镜观察细胞内荧光的数量及强度来评判上述4种方式的感染效率，并用Real—timePCR和Westernblot进行验证。结果慢病毒原液的感染效率极低，仅在少许细胞中看到极微弱的荧光；慢病毒浓缩液的感染效率尚可，约有60％的细胞可以观察到微弱的荧光；慢病毒浓缩液中加入5g／mLpolybrene的感染效率较高，约90％的细胞可以观察到较强的荧光；慢病毒浓缩液

3、中加入10g／mLpolybrene的感染效率极高，几乎全部细胞均可以观察到很强的荧光。结论慢病毒浓缩液中加入合适浓度的polybrene是感染DLBCL细胞株OCI—LY8较为有效的方法。慢病毒的感染效率与细胞的状态、感染复数、polybrene的浓度密切相关。【关键词】Fbw7；慢病毒栽体；悬浮细胞；人淋巴瘤细胞；感染；荧光效率Fbw7rF—boxandWD40repeatdomain—contai—包装质粒pRSV—REV、pCMV—VSVG和pMDLG／ning7)又称Fbxw7、Sel一10、AGO和hCDC4，是定位于pRRE由中

4、山大学肿瘤防治中心谢丹教授提供；pCDH—4q31的抑癌基因，其编码的蛋白Fbw7可介导许多重MSCV—MCS～EF1一GFP+Puro慢病毒过表达质粒由要蛋白质的泛素化。目前，已在很多人体肿瘤中检测广东省人民医院(广东省医学科学院)医学研究中心潘到Fhw7的功能缺失及其底物累积，然而该基因是宇博士惠赠。否参与弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的发生发展，1．1．2细胞培养用品细胞培养瓶、细胞培养皿、细鲜见相关报道。慢病毒载体是来源于人类免疫缺陷病胞冻存管等均为GreinerBio—one公司产品；细胞培养毒一I的一种逆转录病毒，可以将外源目

5、的基因或干基RPMIMedium1640、DulbeccoSmodifiedEagleSme—扰序列(shRNA)整合到宿主细胞的染色体中，从而实dium(DMEM)、胎牛血清(FBS)、Opti—MEM、嘌呤霉现外源性基因的持久表达或敲除。该系统可以携带较素均购自lnvitrogen公司；l，5一二甲基一1，5一二氮十大的目的基因片段，尤其适用于其他方式难以感染的一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)购自Sigma公司。原代细胞、干细胞、悬浮细胞等。近年来由于其较高1．1．3PCR、Westernblot实验用品Trizol购自In—的感

6、染效率和在宿主细胞中持久的作用效应，而得到vitrogen公司；逆转录酶及SYBRGreenMix购自大连宝广泛的应用。。淋巴造血系统的悬浮细胞是较贴壁生物有限公司；Fbw7一抗购自美国SantaCruz(SC一细胞难感染的一类细胞，本实验及相关文献一均显示33196)公司；GAPDH一抗及所有二抗均购自北京中山单纯的慢病毒感染该类细胞的效率并不高。2013年金桥公司。2—1】月，本实验通过比较慢病毒感染悬浮细胞OCI—1．1．4实验仪器恒温水浴锅、Thermo二氧化碳恒温LY8的几种方法，从而找到了适合该类细胞的最佳感培养箱、苏泰生物安全柜

7、、倒置相差显微镜、Olympus倒染方式，成功构建出Fbw7过表达慢病毒载体，为研究置荧光显微镜、台式低速离心机、Beckman超速离心机该基因在淋巴造血系统肿瘤中的机制奠定基础。(XL一90)、Thermo超低温冰箱、Eppendof普通PCR1材料与方法仪、Roche480定量PCR仪、Genesnap化学发光仪等。1．2方法1．1材料1．2．1慢病毒的包装、收集和浓缩(1)用DMEM完1．1．1细胞株、菌株、质粒人DLBCL细胞株OCI—全培养基(含有10％FBS的DMEM培养基)培养LY8及人胚肾细胞株293FT为本实验室所有；感受态

8、293FT细胞，待细胞密度为80％～90％时，向10cm细大肠杆菌E．coliDH5c~购自北京博迈德公司；慢病毒胞培养皿中加入5rnL不含抗生素和FBS的DMEM