过表达Akt1细胞株的构建及鉴定-论文.pdf

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1、浙江理工大学学报(自然科学版)，第31卷，第4期，2014年7月JournalofZhejiangSci-TechUniversity(NaturalSciences)Vo1．31，No．4，Ju1．2014文章编号：1673—3851(2014)04—0462—05过表达Aktl细胞株的构建及鉴定潘姝花，郑婷婷，郑旭升，吴登伟，陈培远，许传莲(浙"2r-．~m大学生命科学学院，杭州310018)摘要：Aktl是细胞信号传导通路中的关键信号分子，具有促进细胞增殖、生长、迁移、侵袭，以及抑制细胞凋

2、亡，抵抗化疗和放疗等重要作用。文章通过构建pLJMl-Aktl重组质粒，利用慢病毒侵染的方法将重组质粒转染至K562、Bel-7404细胞，用嘌呤霉素筛选得到Aktl稳定过表达的Bel一7404／Aktl、K562／Akt1细胞株，通过Westernbloting分析细胞株中Aktl的表达情况。结果显示：Bel一7404／Aktl与K562／Akt1细胞中Aktl表达量明显高于野生型Bel-7404细胞与K562细胞，成功构建过表达Aktl的K562／Aktl、Bel一7404／Aktl稳转细胞

3、株。Aktl过表达细胞株的成功构建为寻找和筛选高效、低毒、强特异性的Aktl抑制剂以及逆转细胞多药耐药(multidrugresistance，MDR)的研究提供了实验模型。关键词：Aktl；重组质粒；病毒侵染中图分类号：Q786文献标志码：AAktl稳定高表达K562与Bel一7404细胞株。本研0引言究旨在运用慢病毒载体的优势构建Aktl高表达细Akt是一种处于PI3K／Akt信号转导通路(又胞株，为寻找和筛选高效、低毒、强特异性的Aktl称Akt或PKB通路)核心部位的丝氨酸／苏氨酸激抑制

4、剂以及MDR的研究提供实验模型，并为后续酶，存在由不同的基因编码的Aktl／PKBa、Akt2／深入研究奠定了基础。PKBfl、Akt3／PKB-／3种亚型，具有促进细胞增殖、1材料与方法生长、抑制细胞凋亡等作用。另外，Akt在促进细胞迁移、侵袭，以及促进血管生成，抵抗化疗和放疗等1．1主要材料与试剂方面也起着重要作用[1]。Akt是存在于人类染色DNA限制性内切酶Agel和EcoRl购自Takara体中的鼠类胸腺瘤病毒(t-8strainfrom／J公司；反转录试剂盒购自TOYOBO公司；Ak

5、tl抗体mouse，Akt8)致癌基因的同源物，已被定义为癌基购自CellSignaling公司~Aktl引物由上海英骏生物因_3]，在多种肿瘤中均存在异常表达和活化现象，如技术有限公司合成。慢病毒载体plJM1、包装载体卵巢癌、胃癌、乳腺癌等l5]。目前，国内外关于(psPAX2、pMD2．G)和大肠杆菌菌株Stbl3由浙江理PI3K／Akt信号通路与药物耐药性关系的研究越来越工大学新元医学与生物技术研究所保存。多，并且该通路被认为是化疗耐药治疗的新靶点[。1．2细胞株许多研究表明化疗药物可增

6、加Akt活化水平，使肿瘤人肾上皮细胞293T、人肝癌细胞Bel一7404、人细胞产生药物化疗耐受，深入研究Akt作用机制，可慢性髓性白血病细胞K562均为浙江理工大学新元为肿瘤基因治疗、抗肿瘤药物开发提供新靶点l_8_。医学生物技术研究所保存。本研究选用pLJM1慢病毒载体，构建重组质粒1．3重组载体构建pLJM1一Aktl，并运用病毒侵染的方法筛选得到提取Bel一7404细胞的总RNA，逆转录得到cD一收稿日期：2O13—12一O4作者简介：潘姝花(1988一)，女，浙江富阳人，硕士研究生，主

7、要从事天然产物方面的研究。通信作者：许传莲，E-mail：chuanlianxu@163．corn第4期潘姝花等：过表达Aktl细胞株的构建及鉴定465分化程度和喉癌发生发展密切相关D83。另有研究[9]KumarA，RajendranV，SethumadhavanR，eta1．AKT发现通过RNA干扰Aktl基因沉默具有抑制喉癌kinasepathway：aleadingtargetincancerresearch[J]．TheScientificWor1dJournal，2013，2013：

8、1—6．细胞增殖，促进细胞凋亡等作用，因此，Aktl可作为[10]HanZ，HongL，WuK，eta1．PhosphoAktmediates喉癌基因治疗的候选新靶点_1。这些结果均表明，multidrugresistanceofgastriccancercellsthroughreg—Aktl在不同的肿瘤细胞中发挥着重要作用。ulationofP-gp，Bcl-2andBaxEJ]．JournalofExperi—深人研究PI3K／Akt通路在多药耐药中的具体mentalandClinical