稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定

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1、稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定作者：陈炜，高娜，王嘉丽，张俊磊，田衍平，安静【摘要】目的筛选出稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECVp50，为研究dynEindynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用奠定基础。方法将构建的pRep50质粒稳定转染至ECV304细胞，通过间接免疫荧光染色和免疫印迹实验进行鉴定。结果经间接免疫荧光染色和免疫印迹实验验证，稳定过表达p50基因的细胞克隆株命名为ECVp50。结论成功建立了稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECVp50，为后续研究积累了有价值的实验资料。【关键词】病毒；微管骨架；逆行性运输；过表达；p50Abstract

2、:ObjectiveToconstructstablep50geneoverexpressioncellsforstudyingtheroleofdynEIndynactinintheretrogradetransportofDenguevirus.MethodsECV304cellsedbymunofluorescenceassay.ResultsThestablep50geneoverexpressioncellsedECVp50.ConclusionThestablep50geneoverexpressioncellshavebeenconstructedsuccessful,

3、icrotubules；retrogradetransport；overexpression；p50病毒感染宿主细胞必须经过吸附到宿主细胞表面、穿入细胞质或内含体、脱壳、早期病毒蛋白合成、基因组复制、晚期病毒蛋白合成、病毒组装/成熟、释放几个步骤，这实际上是一个病毒与宿主细胞相互作用的过程。为了有效地感染宿主细胞，病毒必须进入宿主细胞，到达细胞内的特定区域才能启动并完成自我复制。目前研究证实，病毒主要利用宿主细胞骨架系统或膜运输系统完成其在细胞内的移行。细胞骨架系统由微丝、微管、中间纤维及其摩托蛋白（motorprotein）组成。当病毒利用微管骨架完成其在细胞内的移行时，运输的动力则来

4、自两类摩托蛋白：胞质动力蛋白（cytoplasmicdynein）和驱动蛋白（kinesin）。它们分别介导病毒和病毒蛋白从细胞周边向细胞核方向的逆行性运输，以及从细胞中心向细胞周边区域的顺行性运输［1］。研究显示，多数情况下胞质动力蛋白需要有dynactin复合体的辅助，二者相连形成的dyneindynactin复合体在逆行性运输过程中起了关键作用［2］。dynactin复合体至少由9种蛋白组成，包括Arp1、p50、actincappingprotein等［3］，有3讨论病毒具有严格的细胞寄生性，病毒感染宿主细胞，必须经过吸附、穿入/脱壳、大分子生物合成及组装、释放这样一个完整的

5、复制周期。已知真核细胞中充满的细胞器和由微丝、微管、中间纤维组成的细胞骨架，限制分子量大于500kD分子的自由扩散，若不借助细胞的运输体系，病毒颗粒难于通过粘滞的、半流体的细胞质到达特定目的地。因此只有在宿主细胞内某种运输体系的参与下，病毒运动才能保持一定的目的性和方向性。大量实验证明，病毒颗粒的分布与微管骨架关系密切，病毒利用微管骨架完成其在细胞内的移行。微管（microtubule，MT）广泛存在于各种真核细胞中，与维持细胞形态、细胞运动、细胞分裂有关。微管以靠近核周的微管组织中心（microtubuleorganizingcenter，MTOC）为“－”端，向外周呈辐射状分布。研究

6、表明，微管与病毒和病毒蛋白的胞内运输有关［46］，为运输物质提供轨道并对运输方向具有指导作用，而运输的动力则来自作为摩托蛋白的胞质动力蛋白和驱动蛋白。胞质动力蛋白由2条重链、2条中等链、2条轻中等链和数目可变的轻链组成，ATP和微管结合区域位于重链，而运输货物的特异性与中等链和轻链有关。胞质动力蛋白介导从细胞周边向细胞中心的逆行性运输，驱动蛋白介导从细胞中心向细胞周边区域的顺行性运输。近年来，大量研究显示胞质动力蛋白需要有Dynactin复合体的辅助，dynEin的中等链与dynactin相结合，形成dynEIndynactin复合体，在逆行性运输过程中发挥关键作用。dynactin

7、复合体至少由9种蛋白组成，p50是dynactin复合体中含量居第2位的亚组分，过量表达p50使dyneindynactin复合体的功能受到影响，进而影响到病毒的逆行性运输。Suikkanen等［7］的实验显示，过量表达p50使dyneindynactin复合体的功能受到影响，使大量的病毒颗粒不能运输到微管组织中心区域而弥散在细胞质中。AspasiaPloubidonz等［8］在痘苗病毒的研究中亦得到了类似的结果。登革病毒（de