稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定.doc

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1、稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定（作者:单位:邮编:）作者：陈炜，高娜，王嘉丽，张俊磊，田衍平，安静【摘要】目的筛选出稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECVp50,为研究dyneindynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用奠定基础。方法将构建的pRep50质粒稳定转染至ECV304细胞，通过间接免疫荧光染色和免疫印迹实验进行鉴定。结果经间接免疫荧光染色和免疫印迹实验验证，稳定过表达p50基因的细胞克隆株命名为ECVp50。结论成功建立了稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECVp50,为后续研究积累了有价值的

2、实验资料。【关键词】病毒；微管骨架；逆行性运输；过表达；p50Abstract:ObjectiveToconstructstablep50geneoverexpressioncellsforstudyingtheroleofdyneindynactinintheretrogradetransportofDenguevirus.MethodsECV304cellswerestabletransfectedbypRep50.Thenthestablep50geneoverexpressioncellswereconfirme

3、dbywesternblotandindirectimmunofluoresceneeassay.ResultsThestablep50geneoverexpressioncellswereselectedandidentified,namedECVp50.ConclusionThestablep50geneoverexpressioncellshavebeenconstructedsuccessful,whichlaysabaseforfurtherstudyonrolesofp50invirusinfection.K

4、eywords:virus;microtubules;retrogradetransport;overexpression;p50病毒感染宿主细胞必须经过吸附到宿主细胞表面、穿入细胞质或内含体、脱壳、早期病毒蛋白合成、基因组复制、晚期病毒蛋白合成、病毒组装/成熟、释放几个步骤，这实际上是一个病毒与宿主细胞相互作用的过程。为了有效地感染宿主细胞，病毒必须进入宿主细胞,到达细胞内的特定区域才能启动并完成自我复制。目前研究证实，病毒主要利用宿主细胞骨架系统或膜运输系统完成其在细胞内的移行。细胞骨架系统由微丝、微管、中间纤维及其

5、摩托蛋白(motorprotein)组成。当病毒利用微管骨架完成其在细胞内的移行时，运输的动力则来自两类摩托蛋白：胞质动力蛋白(cytoplasmicdynein)和驱动蛋白(kinesin它们分别介导病毒和病毒蛋白从细胞周边向细胞核方向的逆行性运输，以及从细胞中心向细胞周边区域的顺行性运输［1Jo研究显示，多数情况下胞质动力蛋白需要有dynactin复合体的辅助，二者相连形成的dyneindynactin复合体在逆行性运输过程中起了关键作用［2］odynactin复合体至少由9种蛋白组成，包括Arp1.p50、act

6、incappingprotein等［3］,有文献报道过量表达p50将会使dyneindynactin复合体的功能受到影响，进而影响到病毒的逆行性运输。登革病毒是否也利用微管骨架在dyneindynactin复合体指导下完成逆行性运输，目前尚未见文献报道。为了研究dyneindynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用，本研究将构建的真核表达质粒pRep50稳定转染至ECV304细胞后，经筛选得到细胞克隆株，为进一步的实验研究奠定工作基础。1材料与方法1.1实验材料和主要试剂ECV304细胞、真核表达质粒pRecei

7、verM01a和pRep50由本室保存，转染采用美国Invitrogen公司的Lipofectamine2000脂质体转染试剂，小鼠抗p50单克隆抗体购自BD公司，羊抗小鼠IgGFITC、小鼠抗0actin单克隆抗体和G418购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司。1.2稳定过表达p50基因细胞株的建立ECV304细胞用含10%新生小牛血清(fatalcalfserum,FCS)的DMEM培养基于37°C,5%CO2孵箱内培养。转染前1d,将对数生长期的ECV304细胞以2x1

8、03个/孔接种96孔细胞培养板，于24h以内、细胞融合达80%~90%时将pReceiverM01a与pRedyn质粒转染细胞,pReceiverM01a作为对照(根据说明书步骤操作将96孔细胞培养板的1孔细胞传代至6孔细胞培养板的2孔，稀释约150倍，操作时注意避免胰酶过分消化细胞，吹打细胞应轻柔,每孔中加入2m