稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定论文

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1、稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定论文陈炜，高娜，王嘉丽，张俊磊，田衍平，安静【摘要】目的筛选出稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECVp50，为研究dyneindynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用奠定基础。方法将构建的pRep50质粒稳定转染至ECV304细胞，通过间接免疫荧光染色和免疫印迹实验进行鉴定。结果经间接免疫荧光染色和免疫印迹实验验证.freeledbymunofluorescenceassay.ResultsThestablep50geneoverexpressioncellsedECVp50.ConclusionThe

2、stablep50geneoverexpressioncellshavebeenconstructedsuccessful,icrotubules；retrogradetransport；overexpression；p50病毒感染宿主细胞必须经过吸附到宿主细胞表面、穿入细胞质或内含体、脱壳、早期病毒蛋白合成、基因组复制、晚期病毒蛋白合成、病毒组装/成熟、释放几个步骤，这实际上是一个病毒与宿主细胞相互作用的过程。为了有效地感染宿主细胞，病毒必须进入宿主细胞，到达细胞内的特定区域才能启动并完成自我复制。目前研究证实，病毒主要利用宿主细胞骨架系统或膜运输系统完成其

3、在细胞内的移行。细胞骨架系统由微丝、微管、中间纤维及其摩托蛋白（motorprotein）组成。当病毒利用微管骨架完成其在细胞内的移行时，运输的动力则来自两类摩托蛋白：胞质动力蛋白（cytoplasmicdynein）和驱动蛋白（kinesin）。它们分别介导病毒和病毒蛋白从细胞周边向细胞核方向的逆行性运输，以及从细胞中心向细胞周边区域的顺行性运输［1］。研究显示，多数情况下胞质动力蛋白需要有dynactin复合体的辅助，二者相连形成的dyneindynactin复合体在逆行性运输过程中起了关键作用［2］。dynactin复合体至少由9种蛋白组成，包括Arp

4、1、p50、actincappingprotein等［3］，有文献报道过量表达p50将会使dyneindynactin复合体的功能受到影响，进而影响到病毒的逆行性运输。登革病毒是否也利用微管骨架在dyneindynactin复合体指导下完成逆行性运输，目前尚未见文献报道。为了研究dyneindynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用，本研究将构建的真核表达质粒pRep50稳定转染至ECV304细胞后，经筛选得到细胞克隆株，为进一步的实验研究奠定工作基础。1材料与方法1.1实验材料和主要试剂ECV304细胞、真核表达质粒pReceiverM0

5、1a和pRep50由本室保存，转染采用美国Invitrogen公司的Lipofectamine2000脂质体转染试剂，小鼠抗p50单克隆抗体购自BD公司，羊抗小鼠IgGFITC、小鼠抗βactin单克隆抗体和G418购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司。1.2稳定过表达p50基因细胞株的建立ECV304细胞用含10%新生小牛血清（fatalcalfserum，FCS）的DMEM培养基于37℃，5%CO2孵箱内培养。转染前1d，将对数生长期的ECV304细胞以2×103个/孔接种96孔细胞培养板，于24h以内、

6、细胞融合达80%～90%时将pReceiverM01a与pRedyn质粒转染细胞，pReceiverM01a作为对照（根据说明书步骤操作）。将96孔细胞培养板的1孔细胞传代至6孔细胞培养板的2孔，稀释约150倍，操作时注意避免胰酶过分消化细胞，吹打细胞应轻柔，每孔中加入2mL含10üS的DMEM，37℃孵育48h，以使细胞表达足够量的抗性酶。以含1mg/mLG418和10%FCS的DMEM2mL替换6孔细胞培养板中的培养液，进行筛选，时间约为1周，其间以含G418的培养基换液一次。待镜下观察到有成团的单个细胞克隆生长后，胰酶局部消化，将每个单克隆细胞分别

7、转入24孔细胞培养板培养，仍保持G418筛选压力，但G418浓度降为0.5mg/mL。细胞长至70%～80％融合时，传代细胞扩大培养，G418浓度保持0.5mg/mL。得到的稳定表达pReceiverM01a与pRep50质粒的ECV304细胞株，分别命名为ECVpRe和ECVp50。1.3间接免疫荧光染色将盖玻片置于6孔板中，将ECV304、ECVpRe和ECVp50细胞悬液（2×105个/孔）接种于6孔培养板中的盖玻片上，37℃，5%CO2孵育18～24h。取出细胞爬片，PBS漂洗2～3遍，4%多聚甲醛室温固定20min。PBS漂洗后，0.2%

8、TritonX100/PBS室温通透