Kras突变基因真核表达载体的构建及在不同肝细胞株中的表达-论文.pdf

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1、现代生物医学进展www．shengwuyixue．comProgressinModernBiome~cmeVolA4NO．1JAN．2014DOI：10．13241／j．cnki．pmb．2014．01．004Kras突变基因真核表达载体的构建及在不同肝细胞株中的表达术张晶晶陆小军叶奕菁郭翔(1中山大学附属中山医院肿瘤放疗科广东中山528403；2中山大学肿瘤防治中心鼻咽科广东广州510060)摘要目的：构建携带突变Kras基因，以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组真核表达栽体，并导入两种不同的肝细胞株中表达。方法：PCR扩增突变Kras目的

2、基因，将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上，构建重组质粒载体。并利用脂质体转染人肝癌细胞株Huh7．5和鸡肝癌细胞株LMH，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察Kras．EGFP融合蛋白在细胞中的表达；用WesternBlotting方法验证Kras蛋白水平的表达。结果：酶切和测序证实pEGFP—NI．Kras重组质粒构建正确，将EGFP报告基因融合在突变的Kras基因的3’端；在Huh7．5和LMH中均观察到了绿色荧光，转染率分别为19％和53％；WesternBlot—ing也检测到融合蛋白的表达。结论：通过基因克隆方法成功构建了pEG

3、FP—Nl—Kras重组质粒载体，并且在Huh7．5和LMH中均稳定表达，为下一步筛选针对突变Kras基因的靶向药物奠定了基础。关键词：Kras；突变；绿色荧光蛋白；基因转染中图分类号：Q75，Q78。R730．231文献标识码：A文章编号：1673—6273(2014)01．18．05ConstructionofpEGFP．N1．asExpressionVectorandItsExpressioninDifferentLiverCellLines*ZHANGJing-jing，LUXiao-junYEYi-jing+,GUOXianf(1Departm

4、entofCarcinomaRadiotherapy,AffiliatedZhongshanH0spitalofSunYat-SenUniversity,Zhongshan,Guangdong,528403,China；2DepartmentofNasopharyngealCarcinoma,CancerCenter,SunYat-SenUniversity,Guangzhou,Guangdong,510060,China1ABSTRACTObjective：ToconstructpEGFP-N1eukaryoticexpressionvectorbyu

5、singenhancedgreenfluorescenceproteinasreportergeneandtransfectingtwodiferentlivercelllines．Methods：ThemutatedKrasgenewasamplifiedbyPCRtechniqueandinsertedintopEGFP—N1vector．Thehumanhepatomacellline(Huh7．5)andchickenhepatomacellline(LMH)wastransfectedwiththerecombinantplasmidbymea

6、nsoflipidosome．TheKras—EGFPfusedproteinwasvieweddirectlywithfluorenscemicroscope，andtheexpressionofKraswasdetectedbyWestemBlotting．Results：TherecombinantplasmidwasformedcorrectlybytheanalysesofenzymerestrictionandDNAsequencing．andthe3’endofmutatdKrasgenewasfusedwithEGFPreporterge

7、ne．ThegreenfluorescencecouldbeseeninbothHuh7．5andLMHcelllinesandthetransfectionratewas19％and53％respectively．TheexpressionoffusionproteincouldbedetectedbyWesternBlotting．Conclusions：TheexpressionvectorofrecombinantplasmidpEGFP-N1一Krasissuccessfullyconstructedandisefectivelyexpress

8、edafterbeingtransfectedintoHuh7．5andLMH，