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《鹅SCD1基因真核表达载体构建及在肝细胞中的表达.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、上海交通大学学报(农业科学版)Vo1.32No.2第32卷第2期2014年4月(AGRICULTURALSCIENCE)Apr.2014JOURNAL()FSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY文誊编号:1671—9964(2014)020005—05DOI:10.3969/J.ISSN.1671—9964.2014.02.002鹅SCD1基因真核表达载体构建及在肝细胞中的表达张宜辉,张蕊,张军,王洪荣,龚道清(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009)摘要:构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl—CoADesaturasel
2、,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论
3、:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。关键词:鹅;SCD1基因原代肝细胞;真核表达中图分类号:$858.33文献标识码:AConstructionandExpressionofGooseSOD1GeneinPrimaryHepatocyteZHANG一hui,ZHANGRui,ZHANGJun,WANGHong—rong,GONGDao—qing(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,
4、Yangzhou225009,China)Abstract:Inordertoinvestigatetheinfluenceofgoosestearoyl—CoAdesaturase1(SCD1)Ollfatmetabolism。aeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+)/SCD1wasconstructedandtherecombinantproteinwasexpressedingooseprimaryhepatocyte.SCD1ORFwasamplifiedbyRT-PCRfromgooseliversample
5、s.TheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+)/SCD1wasconstructedbyintroducingSCD1DNAfragmentintothesitesofEcoRIandXho工ofpcDNA3.1(+).TheplasmidpcDNA3.1(~)/SCD1wastransfectedintogooseprimaryhepatocytewithlipofectinmethod.TheexpressionofSCD1wasdetectedandlipidmetabolismgenesSREBPwasupr
6、egulatedbyreal—timePCR.Restrictiveendonucleaseassayandsequenceanalysisverifiedthesuccessfu1constructionoftherecombinantvectorpcDNA3.1(+)/SCD1.ThetranscriptionOfSCD1mRNAwasdetectedintransfectedgooseprimaryhepatocyteandthelipiddropletwasincreased.Thisstudyprovidesafoundationforfurt
7、herstudyonfunctionofSCDJgeneongoosefatmetabolism.Keywords:goose;SCD1gene;primaryhepatocyte;eukaryoticexpression收稿日期:2013—11—05基金项目:江苏省研究生科研创新计划项目(CXZZ12—0912);国家自然科学基金项目(31072021)作者简介:张宜辉(1985一),男,博士生,研究方向:分子营养,E—mail:first222686@126.corn;龚道清(1966一)为本文通讯作者,教授,博导,研究方向:家禽遗传育种,E-mai
8、l:yzgong@163.tom上海交通大学学报(农业科学版)第32卷硬酯酰辅酶
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