cd59基因的突变并真核表达载体的构建

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1、CD59基因的突变并真核表达载体的构建：朱新红高美华任书荣王秋波王静林存智【摘要】　　目的构建两种活性位点相关性CD59突变基因，并重组入真核表达载体。方法选取物种间高度保守D18TVector,EcoRⅠ单酶切获得目的基因，重组入真核表达载体pIRES。结果通过PCR定点诱变成功获得两种目的CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定结果均证实成功构建了pIRESm1CD59、pIRESm2CD59重组真核表达载体系统,突变CD59基因长度约500bp。结论重叠延伸PCR法诱变经济可靠，重组质粒的构建为进一步研究CD59

2、的抗补体活性奠定了基础。【关键词】抗原CD59点突变真核表达　　［ABSTRACT］ObjectiveToconstructtutagenesisandclonemutantsintoeukaryoticexpressionsystem.MethodsThehighlyconservedutantCD59DNAsedbysequenceanalysis.RebinantplasmidsofpIRESm1CD59andpIRESm2CD59edigestionanalysis.Themutantgeneicalandin

3、reliable,andtherebinantsentactivity.　　［KEYAC）的破坏是由GPI锚定糖蛋白CD59完成的[1]。CD59的作用是与MAC装配过程的C8和(或)C9结合,干扰C9的膜插入或多聚化，阻止膜孔道的形成[1,2]。人CD59前体是由128个氨基酸组成的多肽链，成熟蛋白有77个氨基酸，由半胱氨酸富集区组成的两个反向平行片层、5个突出表面的环状结构和一个短螺旋结构排列组成[3]。人CD59广泛分布于血液细胞及各种组织细胞表面。近年来发现，CD59在肿瘤细胞表面过表达，提示CD59与促进肿瘤的生

4、长及保护肿瘤细胞逃逸抗体诱导的补体杀伤有关[4]。研究显示，CD59在肠、卵巢、前列腺、肺、肾、子宫内膜癌及淋巴瘤等多种肿瘤细胞表面过表达。因此，了解CD59与补体配体之间相互作用的分子结构，有助于帮助设计CD59抑制物以提高补体杀伤肿瘤的效果。通过NMR结构分析，CD59与补体结合的部位在53位精氨酸6×10-10m范围，包括D18Tvector,EcoRⅠ内切酶,T4DNA连接酶,MarkerDL2000购自Takara(Japan),TaqDNA聚合酶购自Promega(Madison,109由本室保存。　　1.

5、2主要仪器和设备　　高速低温冷冻离心机（日本KUBOTA公司）,CO2孵箱（美国ThermoForma公司）,倒置相差显微镜、万能荧光显微镜（日本Olympus公司）,PCR扩增仪（美国MJResearchINC公司）,核酸蛋白分析仪（美国EppendorfBIOPhotometer公司）。　　1.3方法　　1.3.1突变部位的选择通过对比各物种CD59的氨基酸序列，发现R结构显示其活性位点位于疏水性沟槽内，1F、M1R）带有诱变位点，中部缺失TGG共３个碱基（TGG编码2F、M2R为突变m2CD59的引物，中间部位有9个

6、碱基的突变，是将TGTTGGAAG突变为TGGTGGTGG的替换突变。引物由上海生工公司合成。见表1。　　表1突变CD59基因引物设计（略）　　1.3.3目的基因的获得及纯化以CD59cDNA为模板，上述引物经重叠延伸PCR三重聚合酶链反应扩增获得目的基因。PCR1:引物为pT7、M1R,反应参数:94℃预变性3min；94℃30s,42℃45s,72℃45s,共25个循环；72℃延伸7min。PCR1扩增前半段CD59。PCR2:引物为M1F和T3,反应参数同PCR1。PCR2扩增后半段CD59,与PCR1产物有27碱基

7、重叠（为引物部分扩增产物）。PCR3:将纯化的PCR1和PCR2扩增产物等摩尔混合为模板,pT7和T3为引物,94℃预变性3min；94℃30s,46℃45s,72℃45s,共25个循环；72℃延伸7min。扩增获得完整的含诱变位点的m1CD59目的基因片段。m2CD59的扩增条件相同，引物不同，PCR1的引物为pT7、M2R,PCR2的引物为M2F、T3,PCR3的引物为pT7和T3。10g/L琼脂糖凝胶上电泳，DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。　　　　1.3.4克隆载体构建PMD18TVector载体长2692bp

8、,含有氨苄青霉素抗性基因，可与PCR扩增产物直接连接。扩增出的m1CD59、m2CD59经纯化后,用T4DNA连接酶与PMD18TVector载体16℃过夜连接,连接产物用CaCl2法转化JM109大肠杆菌,氨苄青霉素筛选。　　1.3.5阳性重组克隆的鉴定PCR反应体系25μL，其中含有转化重组质粒