基因组不稳定肝细胞CDT1基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建.pdf

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1、山西医科大学学报，2015年2月，第46卷第2期·103·基因组不稳定肝细胞CDT1基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建原雅艺，党旭红，张睿凤，张忠新，任越，左雅慧(中国辐射防护研究院放射医学与环境医学所，太原030006；通讯作者，E—mail：yahuiz@163．tom)摘要：目的构建基因组不稳定细胞CDT1基因过表达和RNAi模型，为进一步探讨该基因在辐射诱发基因组不稳定的功能提供研究工具。方法根据CDT1基因信息，以慢病毒载体GV218设计合成两种重组质粒，分别包含CDT1基因全长序列以及阴性对照序列；以慢病毒载体GV248设计合成两种重组质粒，分别包含CDT1基因的小干扰序列以及用

2、于干扰对照的阴性序列。利用Westernblot和qPCR进行过表达和RNAi重组质粒表达的检测。通过转染293T细胞进行慢病毒的包装。利用ELISA和荧光法分别进行滴度的检测。再用包装好的慢病毒感染辐射诱导基因组不稳定性HL-7702肝细胞，利用qPCR检测CDT1表达量。结果测序结果表明重组质粒构建成功，并能够有效转染293T。过表达病毒滴度为4．3×10TU／ml；RNAi病毒滴度为2．0×10TU／ml。过表达慢病毒能有效上调CDT1的表达，过表达效率为65％。RNAi干扰慢病毒能够有效抑制CDT1的表达，抑制效率为88％。结论成功构建基因组不稳定肝细胞CDT1基因过表达和RNAi模型

3、，为进一步研究CDT1在辐射诱发基因组不稳定细胞中的功能提供了有效的研究工具。关键词：CDT1基因；过表达；RNAi；慢病毒载体中图分类号：Q78文献标志码：A文章编号：1007—6611(2015)02—0103—05DOI：10．13753／j．issn．1007—6611．2015．02．001Constructionofrecombinantlentiviralvectorsforradiation-inducedgenomicinstabiHtylivercellsCDT1geneoverexpressionanditsinterferenceRNAYUANYayi，DANGXuho

4、ng，ZHANGRuifeng，ZHANGZhongxin，RENYue，ZUOYahui(InstituteofRadiologyandEnvironmentalMedicine，ChinaInstituteforRadiationProtection，Taiyuan030006，China；Correspondingauthor，E—mail：yahu&@163．eom)Abstract：ObjectiveToconstructtworecombinantlentiviralvetcorscontainingCDT1geneandRNAitargetingCDT1forprovidinga

5、nefectivetoolforthestudyonapossiblemechanismofradiation-inducedgenomicinstability．MethodsAccordingtoGenBank，afull—lengthcDNAsequenceofCDT1andanegativesequenceweredesigned，synthesized，andtheninsertedintoplasmidGV218lentiviralvector．MeanwhileaninterferingsequencetargetingCDT1andanegativesequencewerede

6、signed，synthesized，andtheninsertedintoplasmidGV248lentiviralvector．TheoverexpressionandRNAirecombinantplasmidsweredetectedbyWesternblotandqPCRrespec-tively．Theviralstockwaspreparedbytransfectioninto293Tcells．TheviraltiterwastestedbyELISAandflurometricmethods．Afterinfectionofradiation-inducedgenomici

7、nstability(RIGI)HL-7702livercellswiththeselentiviruses，theexpressionofCDT1genewasdetectedbyqPCR．ResultsAlltherecombinantplasmidswereconfirmedbysequencinganalysisandtheywereeficientlytransfect-edinto29