真核表达质粒pires2egfpannexin a2的构建及其在293t细胞中的表达

《真核表达质粒pires2egfpannexin a2的构建及其在293t细胞中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexinA2的构建及其在293T细胞中的表达：李娜,周红俞颖,王婷黄宏亮,石文霞王海波【摘要】目的：构建含有人AnnexinA2基因的真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexinA2，并在真核细胞293T中表达。方法：将质粒pCMV5AnnexinA2上AnnexinA2基因酶切后与真核表达质粒pIRES2eGFP连接，酶切鉴定及测序正确后，脂质体介导法转染293T细胞，荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测其基因和蛋白的表达。结果：构建的质粒pIRES2eGFPAnnexinA2转染293T细胞后，目的基因mRNA和蛋白表

2、达均明显增高。结论：成功构建pIRES2eGFPAnnexinA2质粒并表达蛋白，为研究AnnexinA2的生物学功能奠定了基础。【关键词】AnnexinA2；真核表达；抗磷脂综合征［Abstract］Objective:ToconstructpIRES2eGFPAnnexinA2eukaryoticexpressionvectorcarryinghumanAnnexinA2geneandexpressAnnexinA2proteinin293Tcell.Methods：AnnexinA2genedigestedfrompCMV5AnnexinA2idpIRES2

3、eGFPAnnexinA2ediationofliposome.TheexpressionofAnnexinA2ePCR.Results：TheexpressionofAnnexinA2atbothmRNAandproteinlevelseAnnexins是一类钙依赖的膜磷脂结合蛋白，脊椎动物细胞的Annexins被命名为AnnexinA家族。其中AnnexinA2由339个氨基酸组成，分子量36kDa，主要表达于人单核细胞、内皮细胞和一些肿瘤细胞中，在细胞的膜形成、膜聚合、胞吞和胞吐中发挥功能。细胞膜上AnnexinA2可作为多种蛋白的受体，在感染发生、肿瘤迁移、血凝

4、和纤溶过程中起着重要作用。研究表明，它可作为纤溶酶原及组织纤溶酶原激活物的共同受体，介导纤溶酶的生成，有利于纤维蛋白的降解，维持纤溶的内稳态［1-3］。最近的研究发现，AnnexinA2异源四聚体可介导纤溶酶与单核细胞结合，传递下游信号，引起趋化作用和炎性介质释放，与慢性炎症的发生发展有关［4］。本小组的研究提示［5］，AnnexinA2在抗磷脂抗体引发的血栓形成中起着重要作用，它可能作为抗磷脂抗体与磷脂结合蛋白复合物的受体，介导下游信号，引起血栓形成。本实验旨在构建真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexinA2，并在293T细胞中表达目的蛋白，为进一步研究Anne

5、xinA2在抗磷脂综合征中的作用奠定基础。1材料与方法1.1材料DMEM及optiMEM培养基购于美国Gibco公司。胎牛血清购于兰州民海生物工程有限公司。逆转录试剂盒购于日本Toyobo公司。rTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶、DL2000,Sybergreen,1kbDNA分子质量标准参照物均购于日本TakaraBiotec公司。质粒抽提试剂盒购于美国Axygen公司。Trizol及LipofectamineTM2000购于美国Invotrigen公司。单克隆鼠抗人AnnexinA2抗体购于美国Diagnostica公司。生物素化的兔抗鼠IgG购于美国S

6、igma公司。ECL显色试剂购于SantaCruz（Europe）公司。真核表达载体pIRES2eGFP，293T细胞由本室保存。质粒pCMV5AnnexinA2由美国McCraeK教授惠赠。1.2方法1.2.1pIRES2eGFPAnnexinA2载体构建将含AnnexinA2基因的真核表达质粒pCMV5AnnexinA2及载体pIRES2eGFP分别用SalⅠ，bglⅡ双酶切（37℃，2h），酶切产物10%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切胶回收。回收后的目的基因AnnexinA2和载体pIRES2eGFP以摩尔浓度3∶1的比例混合，T4DNA连接酶16℃过夜进

7、行黏性末端定向连接。次日将5μl连接产物用热休克法转化感受态E.coliDH5a菌。转化产物涂于LB平板（含100g/ml卡那霉素），待液体吸收后，37℃培养过夜。挑取单个菌落至3mlLB培养基（含100g/ml卡那霉素）中，37℃增菌过夜。次日提取重组质粒进行酶切鉴定，阳性质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。1.2.2转染293T细胞转染前24h胰酶消化293T细胞并种入六孔板内，待细胞生长至60%～80%汇合，换无血清DMEM培养基。将4g阳性质粒pIRES2eGFPAnnexinA2，4g对照质粒pIRE