携sirna真核表达载体靶向脂质微泡的构建与表征

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1、福建医科大学硕士学位论文分类号：R445.1学校代码：10392学科专业代码：105107学号：1210306056福建医科大学硕士研究生毕业论文携siRNA真核表达载体靶向脂质微泡的构建与表征PreparationandCharacterizationofTargetedMicrobubblesCarryingEukaryoticExpressionVectorofSurvivinsiRNA学位类型：临床医学硕士所在学院：协和临床医学院研究生：魏巍丽学科、专业：影像医学与核医学导师：何以敉教授研究起止日期：2012年7月至2013年3月答辩日期：2013年5月23日二

2、○一三年六月福建医科大学硕士学位论文福建医科大学硕士学位论文目录中文摘要………………………………………………………………………………1英文摘要………………………………………………………………………………3前言………………………………………………………………………………………5第一部靶向乳腺癌HER2脂质微泡的构建1材料……………………………………………………………………………………72方法……………………………………………………………………………………83结果……………………………………………………………………………………104讨论…………………………………………………

3、…………………………………13第二部分siRNA真核表达载体的构建1材料……………………………………………………………………………………162方法……………………………………………………………………………………173结果……………………………………………………………………………………224讨论……………………………………………………………………………………24第三部分携siRNA真核表达载体靶向脂质微泡的构建1材料……………………………………………………………………………………272方法……………………………………………………………………………………283结果……………

4、………………………………………………………………………294讨论……………………………………………………………………………………33全文总结…………………………………………………………………………………35下一步研究计划…………………………………………………………………………35参考文献…………………………………………………………………………………36致谢………………………………………………………………………………………39文献综述…………………………………………………………………………………40福建医科大学硕士学位论文携siRNA真核表达载体靶向脂质微泡的构建与表征中

5、文摘要目的：构建沉默人survivin基因的siRNA真核表达载体，采用聚乙烯亚胺胆固醇衍生物将载体连接到脂质微泡，并对微泡进行靶向修饰，使其与乳腺癌细胞膜表面HER-2抗原特异性结合，探索一种新型的乳腺癌RNA干扰治疗基因转染工具。方法：1.采用免疫荧光法检测乳腺癌细胞膜表面HER-2抗原；采用机械振荡法制备脂质微泡，生物素-亲和素桥接法将靶向乳腺癌细胞膜表面抗原HER-2抗体赫赛汀连接到脂质微泡上，观察微泡的形态、密度、粒径及分布范围，并考察其与表达HER-2的乳腺癌细胞SK-BR-3特异性结合的能力。2.设计合成靶向人survivin基因的发夹结构的siRNA模板

6、，克隆至真核表达载体pGPU6/GFP/Neo，构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo-survivin，转化感受态细胞TOP10菌株，扩增并提取质粒，对重组质粒进行酶切鉴定、序列测定。3.以聚乙烯亚胺、胆固醇甲酰氯为原料合成阳离子脂质PEI-Chol，琼脂糖凝胶电泳阻滞试验检测不同N/P比对PEI-Chol结合质粒DNA能力及PEI-Chol/DNA复合物抗核酸酶DNaseI酶解的能力。4.采用反相蒸发-机械振荡法制备载siRNA真核表达载体的脂质微泡，生物素-亲和素桥接法将赫赛汀抗体偶联到脂质微泡，构建携siRNA真核表达载体的靶向微泡，显微镜观察微泡的形态、密度、

7、粒径及分布范围，观察载基因靶向微泡与乳腺癌细胞SK-BR-3的结合能力。结果：1.免疫荧光结果显示，SK-BR-3细胞可与赫赛汀结合发出绿色荧光，而MDA-MB-231未见荧光；采用机械振荡法制备的脂质微泡分散良好，粒径分布8较均匀，平均粒径为(3.1±0.7)μm，密度为1.6×10/ml，生物素-亲和素桥接法成功将赫赛汀偶联到脂质微泡；靶向脂质微泡微泡特异性结合到表达1福建医科大学硕士学位论文HER-2的SK-BR-3细胞。2.靶向survivin的siRNA成功克隆到pGPU6/GFP/Neo质粒载体，重组载体可被限制性内切酶Bam