taco特异性sirna靶向载体系统的构建与鉴定

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1、摘要肠杆菌后，挑取重组阳性克隆进行酶切鉴定和测序鉴定。结果：经限制性内切酶酶切和DNA测序结果证实，siRNA核苷酸序列正确插入到表达载体pGPU6／GFP／Neo中，成功构建了TACO基因特异性的siRNA表达质粒pSTl、pST2、pST3及对照siRNA表达质粒pST4。结论：成功构建了针对TACO基因干扰序列的表达载体pST。第二部分siRNA真核表达质粒在细胞内的表达及其抑制TACO表达效果的检测目的：将干扰质粒pSTl、pST2、pST3和对照质粒pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264．7和293T细胞，在细胞水平检测TACO的表达变化。方法：采用RT-PCR方法

2、自小鼠巨噬细胞系RAW264．7中扩增获取taco基因片段，并将之克隆入真核表达质粒pQE30中，构建重组质粒pQE30．taco。以pQE30．taco作为标准物建立荧光定量PCR法检测taco基因水平的标准曲线。在此基础上，本部分研究采用了三种不同的方法对taco特异性siRNA表达质粒对巨噬细胞TACO表达的影响进行了研究：(1)采用pSTl、pST2、pST3、pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264．7，分别采用荧光定量RT-PCR和免疫印迹法在mRNA和蛋白水平检测巨噬细胞的TACO表达变化。但由于RAW264．7细胞转染效率低下，pSTl、pST2、pST3、pS

3、T4转染后荧光定量RT-PCR和免疫印迹法均未检测到TACO的表达有明显的改变。(2)采用pSTI、pST2、pST3、pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264．7，然后以TACO特异性抗体为一抗，红色荧光蛋白标记的二抗对细胞进行免疫荧光染色，在单细胞水平比较获pST质粒转染(表达绿色荧光蛋白)和未获转染的细胞的红色荧光的荧光强度，评价siRNA表达质粒对TACO表达的影响。(3)利用293T细胞转染效率高，本身不表达TACO的特点，构建TACO与红色荧光蛋白(PEP)表达基因的融合基因表达质粒：pCDNA3．1．Red．taco(简称p3．1．RT)，用p3．1。RT和TAC

4、O特异性siRNA表达质粒共转染293T细胞，再采用免疫印迹方法检测TACO的表达改变。结果：转染RAW264．7细胞后荧光定量PCR和westernblot图片表明没有明显的差异。在pST干扰质粒转染RAW264．7细胞后用TACO蛋白做细胞免疫荧光表明细胞内TACO表达明显的降低。在293T细胞中，在蛋白质水平检测到了TAC0的变化。111摘要IrlllllllllllIUlIrllIII＼1958088结论：pST干扰质粒可使tacomRNA及蛋白水平表达下降。第三部分重组耻垢分枝杆菌菌苗rMs．pSTM的构建及鉴定目的：利用经过基因改造的耻垢分枝杆菌Msl．2c作为载

5、体，靶向递送小干扰RNA的真核表达质粒，观察其靶向性。方法：将分枝杆菌的复制子ORIM用分子克隆的方法连入siRNA表达质粒pSTl．4中，得到pSTMl．4，然后电穿孔入Msl．2c中，构建可靶向递送pSTMl．4质粒进入M①中进行表达的重组耻垢分枝杆菌rMs．pSTMl-4并用PCR的方法鉴定，大量扩增重组耻垢分枝杆菌菌苗rMs．pSTM，并分别用其感染RAW264．7细胞。结果：分枝杆菌的复制子ORIM连入siRNA表达质粒pST中，电穿孔入Msl．2c成功，筛选并大量扩增了耻垢分枝杆菌菌苗rMs．pSTM。感染RAW264．7后，抗酸染色后在细胞中能看到其靶向性。结论

6、：rMs．pSTM感染RAW264．7后，能观察到其靶向性。关键词：siRNA；表达载体；结核病IVAbstractABSTRACTSuppressingthefusionofphagosomeandlysosomeisoneofthemainmechanismsforMtbtosurviveinmacrophage(MQ)．RecentresearchesdemonstratedthatTACO，anendogenousTryptophan-aspartatecontainingcoatproteinofMqo，playsacrucialroleinthesurvivalo

7、fMtbwithinM9．TACOisrecruitedandlocalizedtophagosomesbyliving，butnotdead，Mtb．ThroughretainingTACOonthephagosomemembrane，viableMtbcouldpreventtheirdeliverytolysome，thusevadethedamageofimmunitysystem．IftheexpressionofTACOwereinterrupted，Mtbcouldbereadilytra