靶向dna甲基转移酶1的sirna表达载体的构建与筛选

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1、·600·郑州大学学报(医学版)2010年7月第45卷第4期靶向DNA甲基转移酶1的siRNA表达载体的构建与筛选1)△1)1)1)2)3)赵先兰，孟志英，饶燕玲，孙亚兰，姜国忠，刘红涛1)郑州大学第一附属医院妇产科郑州4500522)郑州大学基础医学院病理学教研室郑州4500013)郑州大学生物工程系郑州450001△女，1965年10月生，博士，教授，研究方向:妇科肿瘤，E-mail:ZXL12129@163．com关键词DNA甲基转移酶1;RNA干扰;HeLa细胞;构建;载体;筛选中图分类号R730．5摘要目的:构建针对DNA甲基转移

2、酶(dnmt1)基因的小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)表达载体，以用于后续的RNA干扰研究。方法:针对人dnmt1的mRNA序列，设计并合成6条编码siRNA的寡核苷酸片段，经退火成互补双链，克隆至载体pSilencer3．1-H1中构建3个重组体，分别命名为pshRNA-dnmt1-A、pshRNA-dn-mt1-B和pshRNA-dnmt1-C，并进行测序鉴定。再利用无内毒素的大提质粒试剂盒制备无内毒素的pshRNA-dnmt1-A、B和C，分别通过脂质体介导转染宫颈癌HeLa细胞，以未转染和转染空载

3、体者为对照。采用RT-PCR和Westernblot检测转染细胞dnmt1mRNA及蛋白表达情况。结果:成功构建了表达靶向dnmt1的siRNA重组载体;转染pshRNA-dnmt1-C对HeLa细胞dnmt1基因的表达几乎无影响。pshRNA-dnmt1-A、B均能有效沉默HeLa细胞中dn-mt1基因的表达，其dnmt1mRNA表达的抑制率分别为21．8%和69．7%，蛋白表达的抑制率分别为27．9%和73．2%，以pshRNA-dnmt1-B的干扰效果最佳。结论:成功构建并筛选出了有效的dnmt1siRNA表达载体。Construct

4、ionandscreeningofsiRNAexpressionvectortargetingatdnmt11)1)1)1)2)3)ZHAOXianlan，MENGZhiying，RAOYanling，SUNYalan，JIANGGuozhong，LIUHongtao1)DepartmentofObstetricsandGynecology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zheng-zhou4500522)DepartmentofPathology，ZhengzhouUnive

5、rsity，Zhengzhou4500013)BioengineeringDepartment，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001Keywordsdnmt1;RNAinterference;HeLacell;construction;vector;screeningAbstractAim:Toconstructthevectorofdnmt1-targetedsmallinterference(siRNA)．Methods:AimedatmRNAse-quenceofhumandnmt1，6nucleot

6、idesencodedsiRNAweredesignedandsynthesized，whichbecomeintocomplementarychainsbyannealing，andthenclonedtocarrierpSilencer3．1-H1toconstructthreerecombinantpshRNA-dnmt1(namedpshRNA-dnmt1-A，pshRNA-dnmt1-BandpshRNA-dnmt1-C，respectively)．pshRNA-dnmt1-A，BandCrecombinationwereplas

7、midcarrierwithoutendotoxinwerepreparedandtransfectedintothecervixcancerHeLacellvialiposome．RT-PCRandWesternblotwereusedtodetecttheexpressionofdnmt1mRNAandproteinaftertransfection．Results:There-combinantplasmiddnmt1-targetedsiRNAvectorwassuccessfullyconstructed．pshRNA-dnmt1

8、-AandBcouldeffectivelysi-lencetheexpressionofdnmt1geneinHeLacellstherecombinantplasmidpsh