dna甲基转移酶3a sirna 真核表达载体的构建和鉴定

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1、DNA甲基转移酶3AsiRNA真核表达载体的构建和鉴定【摘要】目的:构建DNA甲基转移酶3A（DNAmethyltransferases3A,DNMT3A)siRNA重组质粒稳定表达载体，为进一步探讨DNMT3A在多种生物学过程及肿瘤发生发展中的机制提供工具。方法：依据DNMT3A基因的cDNA序列，利用siDESIGN软件获得RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板，体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链，克隆到真核表达载体pSUPEREGFP1中，构建DNMT3AsiRNA重组质粒载

2、体，经酶切鉴定后转染人肝癌细胞系SMMC7721，荧光实时定量PCR初步分析DNMT3A经RNA干涉后的沉默效应。结果：成功构建了靶向DNMT3A基因的siRNA重组稳定表达载体，此载体有效地降低了肝癌细胞系中DNMT3A基因的表达水平。结论：通过该方法初步确定了沉默DNMT3A基因的较佳靶点。【关键词】DNA甲基转移酶3AsiRNA载体DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，参与机体的许多生物学过程，如基因转录抑制、基因组印迹、X染色体失活、染色质完整性的维持、细胞分化和发育的调控等[12]。

3、DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)催化并维持的。人类的DNMT包括DNMT1、DNMT2、DNMT33个家族，其中DNMT3又分为DNMT3A和DNMT3B，它们同是DNA重新甲基化酶[3]。许多研究发现，肿瘤细胞的DNA甲基化模式常发生异常改变，主要表现为基因组的整体低甲基化和局部位点的高甲基化[46]。同时发现DNMT各成员在多种肿瘤中异常表达，其发生往往先于甲基化模式异常，是肿瘤细胞的一个特征性早期分子改变[710]。随着人类表观基

4、因组计划的提出和实施，在各种生物学过程包括肿瘤的发生发展中，DNMT家族不同成员对于甲基化模式建立的确切作用逐渐受到关注[1116]，尤其是DNMT3A基因敲除的小鼠对其功能并没有解析[17]。我们利用RNAi技术，构建靶向DNMT3AsiRNA真核表达载体，检测是否可降低肝癌细胞系中DNMT3A的表达，以期为进一步研究DNMT3A在多种生物学过程中的功能提供良好的工具。1材料及方法1．1材料真核siRNA表达载体pSUPEREGFP1质粒由吴殿青教授（美国耶鲁大学医学院）惠赠，E.coliD

5、H5α购自上海生工生物工程技术服务有限公司，人肝癌细胞系SMMC7721购自上海典型培养物保藏中心，限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ、EcoRⅠ、T4多聚核苷酸激酶、DNA连接酶、SYBRpremixExTaqRMKit、TrizolRNA分离试剂购自TaKaRa公司，质粒抽提试剂盒、转染试剂LipofectamineTM2000、RPMI1640培养基来自Invitrogen公司，凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品，逆转录试剂盒为Promega公司产品，胎牛血清、小牛血清购自兰州民海生物工程

6、有限公司。引物序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。1．2方法1．2．1DNMT3A靶向siRNA设计与合成针对人DNMT3A的cDNA序列(GenBankNo.NM_175629.1,NM_153759.2，NM_022552.3),利用Dharmacon公司的在线设计软件siDESIGN寻找候选DNMT3ARNAi靶点序列。通过BLAST同源性比对分析其是否具有基因特异性。根据pSUPEREGFP1载体要求设计合成siRNA寡核苷酸模板。寡核苷酸序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。1．

7、2．2构建DNMT3AsiRNA的稳定表达载体将合成的寡核苷酸分别溶解在3.36μlH2O中（终浓度为1mmol·L-1），取1μl寡核苷酸,加入48μl的退火缓冲液（100mmol·L-1醋酸钾、2mmol·L-1醋酸镁、30mmol·L-1HEPESKOH,pH7.4）中,95℃5min后缓慢冷却退火至室温，形成短双链。再与经BglⅡ和HindⅢ双酶切的pSUPEREGFP1载体连接后转化DH5α感受态细胞,挑取卡那霉素（100μg·ml-1）阳性的克隆，培养后少量抽提重组质粒，经BglⅡ

8、单酶切和EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，分别命名为pSUPEREGFP1S3A1、pSUPEREGFP1S3A2、pSUPEREGFP1S3A3。1．2．3细胞培养和重组质粒转染肝癌细胞系SMMC7721培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养基中。转染前1d,按照2×106瓶-1的浓度在25ml的细胞培养瓶中接种细胞，过夜培养后细胞汇合率达到70％～80％。转染按LipofectinamineTM2000转染试剂说明书操作。其中脂质体10μl,重组质粒4μg。