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《人dna甲基化转移酶3b1真核表达载体的构建和鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定作者：姜树原邵国张胜黄丽华龚向峰周立社【摘要】目的：构建人DNA甲基化转移酶3B1(DNMT3B1)真核表达载体pCMV-DNMT3B1。方法：根据Genebank中人DNMT3B1cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT3B1,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中。结果：PCR扩增得到人DNMT3B1的cDNA片段大小为2.6kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B1。结论：成功构建了人DNMT3B1
2、真核表达载体,为进一步研究DNMT3B1提供了条件。【关键词】DNA甲基化转移酶3B1;构建;鉴定 AbstractObjective:ToconstructandidentifytheeukaryoticexpressionplasmidforhumanpCMV-2B-DNMT3B1.Methods:AccordtothepublishedhumancDNAsequenceinGenebank,apairofprimerswererespectivelydesignedandsynthesized.ThetotalRNAwasisolatedfromHCT116cell.
3、Afteramplificationwithreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR),theproductwasclonedintopCMV-2Bvector.Therecombinants9werefinallysequencedandidentifiedbyrestrictiveendonucleasedigestion.Results:pCMV-DNMT3B1eukaryoticexpressionvectorswassuccessfullyconstructed,anditwasidentifiedbyP
4、CR,doublerestrictiveendonucleasedigestionandsequenceanalysis.Conclusion:TheDNMT3B1eukaryoticexpressionvectorswassuccessfullyconstructedandidentified. KeywordsDNMT3B1;Construction;Identification DNA甲基化是真核基因组修饰的一种重要方式，DNA甲基化出现于CpG二核苷酸中的胞嘧啶上[1]。真核细胞DNA甲基化由DNA甲基化转移酶(DNMT)催化，目前发现的DNMT有DNMT1、D
5、NMT2、DNMT3A、DNMT3B及DNMT3L，其中DNMT1为维持型甲基化酶，DNMT3A和DNMT3B为从头合成型甲基化酶，DNMT3L单独没有活性，但其可以与DNMT3A或DNMT3B相互作用而调节其活性，目前还没有DNMT2的具体功能的报道。在PeterJohn研究小组的文章中指出，癌症病人样本中发现5/10的DNMT3A上调、6/10的DNMT1上调、8/10的DNMT3B上调，且DNMT3B上调的幅度最大，与对照相比，平均增加7.5倍。因此，DNMT3B在癌症的发生中可能有重要作用[2]。我们成功地构建了DNMT3B1的真核表达载体，为进一步研究DNMT3B
6、的功能奠定了基础。 1材料与方法9 1.1主要材料和试剂 HCT116细胞购于上海细胞所，Trizol购自GIBCOBRL公司，反转录试剂盒购于invitrogen公司，限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ购于Takara公司，ExpandHighFidelityPCRSystem及rapidligationKit购于Roche公司，DNA回收试剂盒购于Qiagen公司。 1.2方法 1.2.1总RNA提取 将人HCT116细胞在培养皿中培养至对数生长期,用冷PBS洗涤后,每孔加入Trizol1mL,吹打均匀后加入200μL氯仿,混匀,4℃、12000rpm离心1
7、5min,取上清液,然后加入500μL异丙醇沉淀,混匀后,室温放置10min,4℃、12000rpm离心10min,沉淀物用70%乙醇洗一次,4℃,7500rpm离心10min,沉淀物用真空抽干,溶于20μLDEPC水中备用。 1.2.2RT-PCR 取总RNA5μg用DEPC水调整至11μL,然后加入1μ9Loligo-dT,1μL10mMdNTP，65℃放置2min后置于冰上,加入6μL反应缓冲液(1μl0.1MDTT,4μL5×buffer，1μLRnaseout)，37℃放置10min后加入逆转录酶,3
