htshr胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达

《htshr胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达【摘要】目的:构建人类促甲状腺激素受体（hTSHR）胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf（aa29～100）、hTSHRe（aa101～278）的真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe,并在CHO细胞中进行表达。方法:RTPCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO中,经酶切、PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达,RTPCR扩增转染细胞的

2、cDNA、r）分别为11900、23600左右,与预期的大小相符。结论:真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe构建成功,RTPCR和r）为84500,分为膜内区、跨膜区以及膜外区3个部分［1,2］,编码hTSHR膜外区的基因长度是1300bp,研究表明TSHR是许多自身免疫性甲状腺疾病（autoimmunethyroiddisease,AITD）中主要的自身抗原之一,TSHR膜外区（TSHRextracellulardomain,TSHRECD）是其免疫原性区段,抗TSHR的抗体大多结合于此段。

3、本研究中克隆hTSHRECD氨基端的2个片段编码序列（188～403bp,407～904bp）,构建其真核表达载体,并转染CHO细胞,进行稳定表达。　　1材料和方法　　1.1材料CHO细胞由中国医学科学院血液病研究所药理室熊东升研究员惠赠,酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司,Ham’sF12、G418、OptiMEM无血清培养基购自Gibco公司;FBS和bTSH购自Sigma公司。真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO和感受态E.coliTOP10购自Invitrogen公司。DNA快速纯化回收试剂盒、

4、限制性内切酶HindⅢ以及PyrobestDNA聚合酶购自TaKaRa公司;MMLV逆转录酶试剂盒、化学发光试剂盒购自Promega公司;质粒回收纯化试剂盒购自博大泰克公司;TRIzol试剂、脂质体LipofectamineTM2000Reagent及小鼠AntiHis单克隆抗体（mAb）购自Invitrogen公司;引物设计合成由上海英俊公司完成。　　1.2方法　　1.2.1PCR引物设计与合成根据GenBank公布的hTSHRcDNA序列（GenBank:000369）序列分别设计片段188～403bp的引物F4:5′cac

5、catggagtgccatcaggaggag3′,R4:5′actcaaattgtagaaggagtgtg3′;片段407bp～940bp的引物F5:5′caccatggtgactcacatagaaat3′,R5:5′tgggtaagaaaggtcagcc3′。上游引物的5′端序列起始密码子ATG前加人Kozak序列（划线部分）以提高转录起始的效率［3］。　　1.2.2组织材料获取与总RNA的提取人正常甲状腺组织30mg,加入1mLTRIzol,匀浆后加入200μL氯仿,摇匀,室温孵育2～3min,4℃,11000g离心

6、15min,取上清水相至新离心管中;加400μL异丙醇,室温孵育10min,4℃,11000g离心10min;弃上清,用1mL750mL/L乙醇洗涤1次,4℃,11000g离心5min;弃上清,空气中干燥10min,加RNasefree水溶解,测RNA浓度,-70℃保存。　　1.2.3RTPCR将人甲状腺正常组织RNA,逆转录为cDNA,以hTSHRcDNA为模板,用PyrobestDNA聚合酶PCR扩增TSHR片段,上下游引物分别1μL（10mmol/L）,dNTP1μL（2.5mmol/L）,10×buffer2.5μL,Py

7、robestDNA聚合酶0.30μL（1U）,模板2μL（约150ng）,ddH2O17.2μL。反应参数:95℃预变性2.5min,95℃变性45s,hTSHRf62.7℃、hTSHRe54.1℃退火45s,72℃延伸45s,34个循环;72℃再延伸5min。10g/LTAE琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。　　1.2.4载体构建与鉴定将回收的hTSHRf、hTSHRe分别与载体1.5∶1混合进行连接,然后将重组体转化E.coliTOP10,冰上放置5～30min,42℃热休克30s后,立即置于冰上,加250μL的S.O.C培基37℃摇

8、床,1h;铺板于Amp+的琼脂糖培养基上,37℃温箱孵育16h;挑取单个菌落于LB液体培养基中,扩大培养,小量提取质粒DNA,以质粒DNA为模板,分别以F4∶R4和F5∶R5为引物,PyrobestDNA聚合酶扩增hTS