dna甲基转移酶3a sirna 真核表达载体的构建和鉴定论文

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1、DNA甲基转移酶3AsiRNA真核表达载体的构建和鉴定论文【摘要】目的:构建DNA甲基转移酶3A（DNAmethyltransferases3A,DNMT3A)siRNA重组质粒稳定表达载体，为进一步探讨DNMT3A在多种生物学过程及肿瘤发生发展中的机制提供工具。方法：依据DNMT3A基因的cDNA序列，利用siDESIGN软件获得RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板，体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链，克隆到真核表达载体pSUPEREGFP1中，构建DNMT3AsiRNA重组质粒载体，经酶切鉴定后转染人肝癌细胞系SMMC77

2、21，荧光实时定量PCR初步分析DNMT3A经RNA干涉后的沉默效应。结果：成功构建了靶向DNMT3A基因的siRNA重组稳定表达载体DesignCenter)寻找候选DNMT3ARNAi靶点序列。通过BLAST(.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)同源性比对分析其是否具有基因特异性。根据pSUPEREGFP1载体要求设计合成siRNA寡核苷酸模板。寡核苷酸序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。1．2．2构建DNMT3AsiRNA的稳定表达载体将合成的寡核苷酸分别溶解在3.36μlH2O中（终浓度为1mmol·L-1），取1μl

3、寡核苷酸,加入48μl的退火缓冲液（100mmol·L-1醋酸钾、2mmol·L-1醋酸镁、30mmol·L-1HEPESKOH,pH7.4）中,95℃5min后缓慢冷却退火至室温，形成短双链。再与经BglⅡ和HindⅢ双酶切的pSUPEREGFP1载体连接后转化DH5α感受态细胞,挑取卡那霉素（100μg·ml-1）阳性的克隆，培养后少量抽提重组质粒，经BglⅡ单酶切和EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，分别命名为pSUPEREGFP1S3A1、pSUPEREGFP1S3A2、pSUPEREGFP1S3A3。1．2．3细胞培养和重

4、组质粒转染肝癌细胞系SMMC7721培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养基中。转染前1d,按照2×106瓶-1的浓度在25ml的细胞培养瓶中接种细胞，过夜培养后细胞汇合率达到70％～80％。转染按LipofectinamineTM2000转染试剂说明书操作。其中脂质体10μl,重组质粒4μg。实验对照组分为只加4μg空载pSUPEREGFP1质粒和不加质粒只加转染试剂的SMMC7721空白组。上述转染细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养5h后，加入含20%小牛血清的RPMI1640培养液1.2ml,继续培养12h。换含10％小牛血清

5、的RPMI1640培养液，继续培养72h后，以1∶10的比例将细胞传代于含抗性药物G418（350μg·ml-1）的RPMI1640中，进行瞬时表达的检测和稳定表达的筛选。包含各重组质粒和对照质粒的细胞系分别命名为S3A17721、S3A27721、S3A37721、pSUPER7721。1．2．4荧光实时定量PCR分析DNMT3AsiRNA载体的沉默效率各转染细胞系培养至70％～80％汇合时，经Trizol一步法抽提总RNA,取2μg总RNA逆转录获得各细胞系cDNA第一链。DNMT3A上游引物5′TATTGATGAGCGCACAAG

6、AGAGC3′,.freelixExTaqTM10μl、上下游引物(10μmol·L-1)各0.5μl、模板cDNA1μl、ddH2O8μl。反应条件为95℃5min、95℃15s、65℃1min，共40个循环。基因表达的相对定量方法按文献推荐方法19操作。以βactin为对照，获得DNMT3A的相对表达差异。每一实验重复3次，每次设置3复孔。2结果2．1DNMT3A基因候选siRNA靶序列的筛选和合成利用siDESIGN软件我们获得8条DNMT3A基因候选siRNA靶序列。结合Reynolds等20总结的siRNA设计原则和BLAST比对结

7、果，最终筛选出3条候选RNAi靶向序列，每条长度为19nt，分别命名为S3A1、S3A2和S3A3，均位于DNMT3AmRNA的编码区（表1）。表1候选siRNA靶序列在DNMT3A基因不同转录本中的位置根据pSUPEREGFP1载体要求合成的siRNA寡核苷酸模板长度为64nt，其中，19nt与DNMT3A靶基因同源，19nt与靶序列反义互补，中间相隔9nt的茎环结构。序列末端含有BglⅡ、HindⅢ酶切位点残基及作为终止信号的5个胸腺嘧啶等（表2，其中大写部分是RNAi靶点正义序列及其反义互补序列)。人类DNMT3A基因有4个mRNA转录本

8、（图1），DNMT3A的甲基转移酶活性主要依靠其羧基端酶催化区6个进化上保守的结构区域完成，DNMT3A第4个转录本丧失该酶催化区，理论