一株家养野猪源猪圆环病毒2型的分离与鉴定

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一株家养野猪源猪圆环病毒2型的分离与鉴定王海燕高崧*刘秀梵(扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州225009)摘要:应用PCR方法从临诊疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)家养野猪病例的淋巴结和脾脏中扩增出预期长度的猪圆环病毒2型(PCV2)的DNA片段,在Dulac细胞中进行分离和培养,扩增全基因组序列后进行同源性分析。结果显示,扩增产物与家猪源参考毒株的序列同源性均在98%以上,该病毒与家猪源病毒差异不大。关键词:家养野猪,猪圆环病毒2型,分离,鉴定IsolationandIdentificationofPorcineCircovirusType2VirusfromaDomesticatedWildBoarWANGHai-YanGAOSong*LIUXiu-Fan(KeyLaboratoryofAnimalInfectiousDiseasesofMinistryofAgriculture,YangzhouUniversity,Yangzhou225009)Abstract:Thenucleicacidfragmentofporcinecircovirustype2(PCV2)wasamplifiedusingPCRfromthetissuesofadomesticatedwildboarwithsuspectedpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS).ThesampleweretheninoculatedintotheDulaccellsandpassagedfor8generation.The4nucleicacidfragmentscoveredthecompletegenomeforPCV2wereobtainedbyover-lappingPCRandsenttosequence.Thesequenceofgenomewascomparedwithother9strainsoriginatedfrompigletsinthesamearea.Theresultshowedthatthesestrainswereinhighhomology.Keywords:Domesticatedwildboar,Porcinecircovirustype2,Isolation,Identification猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2,PCV2)能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postwea-ningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)、猪皮炎与肾病综合征、繁殖障碍等疾病[1]。PMWS是一种以断乳仔猪渐进性消瘦、呼吸困难、腹泻、贫血、明显的淋巴组织病变为主要特征的疾病[1,2]。自1991年在加拿大首次发现PMWS以来,欧美多个国家和日本相继报道了PMWS的发生和流行[3-6],我国首次分离到该病毒是在2001年[7]。随后国内学者们证实该病毒在我国猪场广泛存在并造成了巨大经济损失[8-10]。家猪和野猪被认为是PCV2的自然宿主[1],目前野猪感染发病的报道很少[11,12]。近年来,我国多个地区开始饲养野猪或杂交野猪,随着野猪进入饲养环境中并与家猪接触,其生存的生态和环境发生了变化,与家猪携带的病原体接触频率增高,一些传染病开始出现和流行。本研究对从疑为PMWS的野猪病料中分离到的一株PCV2进行了鉴定。1材料与方法1.1病料和生物材料来自江苏某猪场,病猪死亡前主要表现体温升高、消瘦、呼吸困难等临床症状,剖检取病变的淋巴结、肺和脾脏组织,置于-70°C超低温冰箱中保存备用。Dulac细胞(无PCV1污染)由本室保存。PCV1参考毒株由本室分离保存; PCV2标准毒株由南京农业大学陈溥言教授惠赠。PCV2分离株ChangZhou0511、DaFeng0609、GaoYou0707、HuaiAn0609、SuZhou0511、Taizhou0512、TianChang0603、YangZhou0608和YangZhou0705均由本室分离保存。1.2培养基和试剂DMEM为美国GIBCO公司产品;NCS购自Hyclone公司;TaqDNA聚合酶(含10×Buffer)、dNTP、100bpDNAMarker购自大连TaKaRa生物工程有限公司;蛋白酶K、胰酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司;其他试剂均为国产分析纯产品。1.3PCV2特异性引物引物参照文献[13],扩增的PCV2片段为404bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司。1.4病料处理取疑似PCV2感染的野猪脾和淋巴结加入含2000U青、链霉素的0.01mol/LpH7.4PBS液研磨,离心取上清液500µL。1.5DNA的提取加入终浓度为20µg/mL胃蛋白酶K和1%SDS,58°C消化30min,用等体积的酚：氯仿(1:1,V/V)抽提,2倍体积冷乙醇沉淀DNA,将DNA溶解在25µL含20µg/mLRNaseA的pH7.5TE缓冲液中,取4µL作为PCR反应模板。1.6病料中PCV2特异性基因片段的扩增PCR反应体系为50µL,实验操作按参考文献[13]进行。1.7病毒分离和鉴定组织样品按1:5倍的体积加入DMEM细胞培养液研磨,反复冻融3次,12000r/min离心30min,取上清,0.22μm滤膜过滤除菌接种单层Dulac细胞。37°C孵育1h后换上含1%NCS的DMEM继续培养84h,收获病毒液。取第一代培养物,再接种单层Dulac细胞,同时设不接种病毒的Dulac细胞作空白对照,连传8代。传代过程中通过PCR定性检测Dulac细胞中PCV2增殖情况。按1.5的方法提取全基因组DNA。1.8PCV2全基因组的扩增参照AnDongJun等[14]设计的引物合成了4对引物进行重叠PCR。引物序列见表1。表1引物序列(5′–3′)Table1Primersequence(5′–3′)编号PrimerNo.方向Orientation核苷酸位置aNucleotidepositiona序列(5′–3′)Sequence(5′–3′)P1Sense116–135TAATCCTTCCGAAGACGAGCP2Antisense726–745CGATCACACAGTCTCAGTAGP3Sense531–550CAGAAGCGTGATTGGAAGACP4Antisense1142–1161ATGTAGACCACGTAGGCCTCP5Sense863–882AGAAGCTCTTTATCGGAGGAP6Antisense1545–1564AAGCGAACCACAGTCAGAACP7Sense1360–1379CTAGAATAACAGCACTGGAGP8Antisense193–214GTTCGTCCTTCCTCATTACCCT注：a:核苷酸位置为GenBank中AF201897的序列Note:a:NucleotidepositionbasedonthegenomesequenceofstraindepositedinGenBank(accessionnumberAF201897)其中,P1和P2扩增629bp的片段,P3和P4扩增630bp的片段,P5和P6扩增701bp的片段,P7和P8扩增621bp的片段。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,临用前用灭菌超纯水配成25pmol/L,-20°C保存备用。PCR反应体系为50µL,实验操作按参考文献[14]进行。1.9DNA片段的纯化回收及测序PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,用AgarosegelDNAextractionkit(Roche公司)按产品说明书回收片段,最后用40µL缓冲液或超纯水洗脱,寄出测序。 2结果与分析2.1病料中PCV2特异性基因片段的扩增结果提取全基因组DNA进行PCR扩增发现,病料、接种病料的细胞液均出现404bp的PCV2特异条带,阴性对照细胞中未扩增出相应条带(见图1)。2.2病毒的分离和鉴定结果病料组织在Dulac细胞上传代后经PCR鉴定,证实分离到了PCV2病毒,命名为JiangYan_boar0710。2.3全基因组的扩增将PCV2分离株经重叠PCR扩增后,1%琼脂糖凝胶电泳,紫外光下观察可见该分离株获得4个与预期大小相符的目的条带,将PCR产物测序。2.4基因组全长序列测定该毒株全基因组序列测定2个克隆,核苷酸序列一致,提交GenBank,序列号为EU503035。2.5基因组全长序列分析拼接后该毒株全基因组长度1767个核苷酸。运用DNAstar5.0软件对该毒株与同期在江苏地区分离的9个毒株序列(GenBank号为EU503031~EU503034、EU503036~EU503040)进行了比较,结果发现同源性很高,在98.9%~99.5%之间,说明该病毒可能在家猪和野猪之间相互传播(见图2)。图1PCR扩增结果Fig.1PCRproductofthePCV21:100bpDNALadderMarker;2:未接种病料的Dulac细胞PCR扩增结果;3:接种病料的Dulac细胞PCR扩增结果;4:病料PCR扩增结果1:100bpDNALadderMarker;2:PCRproductoftheDulaccell;3:PCRproductoftheDulaccellinoculatedwithsampleofthewildboar;4:PCRproductofthesampleofthewildboar图210株PCV2分离株基因组的相似性Fig.2Thepercentageofthesimilarityamongythe10isolatesofPCV23讨论加拿大学者首次报道猪圆环病毒2型感染家猪引起PMWS后,该病毒感染的报道越来越多[3-6]。郎洪武等人首次报道在我国分离出该病毒[7],流行病学调查显示PCV2感染率越来越高[8,9],但我国尚未见对野猪感染该病毒病例的报道,国外一些学者对野猪进行了血清流行病学调查和病毒携带状况调查,证实野猪广泛带毒,血清阳性率也很高,在2007年首次报道了野猪感染发病的病例[11,12]。我国部分山区存在一定量的野猪群,有些地区将捕获的野猪与家猪杂交或将家猪放养与野猪杂交,杂交的猪在市场上价格较高。也有部分地区开始饲养野猪进行驯化和繁殖,野猪肉价更高。随着这些养殖活动的开展,家猪和野猪生态系统出现了新的变化,出现了新的生态学嵌合体,这些都为疫病的传播提供了条件。本文从一家养病野猪中分离到了一株PCV2病毒, 进行了全基因组序列测定,并与同期该地区家猪中分离到的PCV2病毒基因组进行了比较,结果发现这些病毒毒株之间同源性很高。这些结果表明PCV2病毒可以在家猪和家养野猪之间传播,为我国PCV2病毒感染控制带来了新问题。目前我国动物疫病的防制体系仍不完善,类似新问题提醒我们在进行养殖活动中要考虑疾病传播的生态学。参考文献[1]StrawBE,ZimmermanJJ,D’AllaireS,etal.Diseasesofswine.9thedition.Iowa:Blackwellpublishing,2006,pp.299-308.[2]NayarGP,HamelA,LinL,etal.Detectionandcharacterizationofporcinecircovirusassociatedwithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigs.CanVet,1997,38(6):385-386.[3]AllanGM,McNeillyF,KennedyS,etal.Isolationofporcinecircovirus-likevirusesfrompigswithawastingdiseaseintheUSAandEurope.JVetDiagnInvest,1998,10(1):3-10.[4]KennedyS,AllanG,McNeillyF,etal.PorcinecircovirusinfectioninNorthernIreland.VetRec,1998,142(18):495-496.[5]OnukiA,AbeK,TogashiK,etal.DetectionofporcinecircovirusfromlesionsofapigwithwastingdiseaseinJapan.JVetMedSci,1999,61(10):1119-1123.[6]SegalesJ,SitjarM,DomingoM,etal.Firstreportofpost-weaningmultisystemicwastingsyndromeinpigsinSpain.VetRec,1997,141(23):600-601.[7]郎洪武,王力,张广川,等.猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰竭综合征的诊断.中国兽医科技,2001,31(3):3-5.[8]王忠田,杨汉春,郭鑫.规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查.中国兽医杂志,2002,38(10):3-6.[9]宋建国,高生智,魏润生.规模化猪场猪圆环病毒2型感染的血清学调查.中国兽医科技,2004,34(12):26-28.[10]叶俊平,盛瑜,朱丽娜,等.江苏省猪高热病病例主要继发感染病毒的多重PCR检测.中国兽医科学,2007,37(12):1029-1034.[11]Ruiz-FonsF,VicenteJ,VidalD,etal.SeroprevalenceofsixreproductivepathogensinEuropeanwildboar(Susscrofa)fromSpain:theeffectonwildboarfemalereproductiveperformance.Theriogenology,2006,65(4):731-743.[12]LipejZ,SegalesJ,JemersicL,etal.Firstdescriptionofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)inwildboar(Susscrofa)inCroatiaandphylogeneticanalysisofpartialPCV2sequences.ActaVetHung,2007,55(3):389-404.[13]QuintanaJ,SegalesJ,RosellC,etal.Clinicalandpathologicalobservationsonpigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndrome.VetRec,2001,149(12):357-361.[14]AnDJ,RohIS,SongDS,etal.Phylogeneticcharacterizationofporcinecircovirustype2inPMWSandPDNSKoreanpigsbetween1999and2006.VirusRes,2007,129(2):115-122.gggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg稿件书写规范专论与综述论文的撰写要点专论与综述是本刊重要栏目之一,主要反映国内外微生物学各分支学科研究最新成果和进展,其内容要求新颖丰富,观点明确,论述恰当,应包含作者自己的工作内容和见解。因此,作者在动笔之前必须明确选题,一般原则上应选择在理论和实践中具有重要意义的学科专题进行论述。围绕专题所涉及的各个方面,在综合分析和评价已有资料基础上提出其演变规律和趋势,即掌握其内在的精髓,深入到专题研究的本质,论述其发展前景。作者通过回顾、观察和展望,提出合乎逻辑并具有启迪性的看法和建议。另外,作者也可以采用以汇集文献资料为主的写作方法,辅以注释,客观而有少量评述,使读者对该专题的过去、现在和将来有一个全面、足够的认识。需要特别说明的是：在专论与综述中引用的文献应该主要是近5年国内外正式发表的研究论文,引用文献数量不限。