猪圆环病毒的分离鉴定与检测方法的建立

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1、摘要猪圆环病毒（PCV）是近年受到广泛关注的危害世界养猪业的重要病源之一。PCV具有PCV1和PCV2两种基因型。根据致病性、抗原性、核苷酸序列，将从PK15细胞系分离的圆环病毒列为圆环病毒1型（PCVl），把与断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）等密切相关的圆环病毒列为2型（PCV2）。本研究主要是从河北保定地区某猪场疑似PMWS的发病猪病料中分离到一株病毒，经PCR鉴定、生物学特性的鉴定，进而建立快速准确的临床诊断方法。无菌采集疑似PMWS的病猪病料，将其腹股沟淋巴结接种PK-15细胞。由于猪圆环病毒在PK-15细胞上不产生

2、细胞病变，接种72h后收毒，盲传至四代。根据GenBank上已发表的PCV2基因序列，设计并合成了一对扩增ORF2基因序列的特异性引物，对细胞毒提取DNA，经PCR扩增，得到485bp特异性的核酸片段。本研究采用过氧化物酶单层实验（IPMA）测定PCV2分离毒的TCID50，并基于此方法对理化特性进行研究。实验结果表明：该毒株病毒液在PH3和PH12作用1h后TCID50均没有显著变化，毒株表现出较强的耐酸碱性；对胰蛋白酶不敏感；经乙醚、氯仿处理后TCID50的差值均小于2，说明该病毒没有囊膜。试验结果均符合PCV2生物学特性。

3、根据Genbank上已发表的猪细小病毒（PPV）和猪伪狂犬病毒（PRV）的基因序列，应用PrimerPremier5.0软件进行分析，设计并合成扩增PPVVP2基因片段和PRVUL39基因片段的特异性引物，并建立多重PCR的方法，在同一个反应体系中可同时扩增PCV2、PPV和PRV的特异性片段。通过对引物用量、反应温度、模板用量等反应条件的优化，达到较为理想的扩增效果，并且特异性和重复性良好。之后对PCV2的PCR产物用XbaI单酶切，获得了267bp和228bp的两个片段，并构建质粒pMD18T-PPV和pMD18T-PPV，

4、分别用BamHI和HindIII双酶切，获得PPV158bp和PRV219bp的目的片段，之后通过序列测序，分别证实了扩增的条带的准确性。本研究建立了用于检测PCV2的双向乳胶凝集实验的诊断方法，通过对乳胶最佳致敏浓度、最佳致敏温度和最佳致敏时间的测定，确定致敏乳胶的最佳条件，并对致敏乳胶的稳定性进行检验，包括保存的温度和保存时间的检查。乳胶凝集抗原质量的鉴定包括用PBS、BBS、生理盐水进行的自凝性检测和用PRV阳性血清、猪瘟阳性血清、PCV阴性血清和犊牛血清进行的特异性检测。结果表明，本研究所建立的PCV2双向乳胶凝集实验准

5、确快速、简便特异，适用于基层单位用于血清学诊断。关键词：猪圆环病毒；理化特性；多重PCR；双向乳胶凝集实验IsolationandIdentificationofPorcineCircovirusandEstablishmentofDetectionMethodsAuthor:HanXinyingSupervisor:ProfessorYangRundeSpecialty:PreventiveVeterinaryMedicineAbstractPorcinecircovirus（PCV）isoneofinfectiousdise

6、asesourcesintheworldwhichwaswidesreadfocuson.Therearetwogenotypes,PCV1andPCV2.Accordingtopathogenicity,antigenicityandnucleotidesequence,theporcinecircovirus,whichwasgainedfromPK-15cellline,wascalledPCV1,andtheporcinecircovirus,whichwasrelatedwithpostweaningmultisyst

7、emicwastingsyndrome（PMWS）,wascalledPCV2.Inthisstudy,aPCV2strainwasgainedfromswines,whichwassuspecttoPMWSandfromHeBeiBaodingarea.ThisstrainwascharacterizedbyPCRandphysicochemicalaffection,andaclinicaldiagnosismethodwasestablished,whichwasfastandprecise.ThePCV2strainwa

8、sgettedfromPK-15celllinewhichwasinoculatedbylymphoglandulaeinguinales,TheorganismwasfromswinewhichwassuspecttoPMWS.Forcytopathiceff