眼斑芫菁全长cDNA文库的构建及EST序列分析

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1、重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要眼斑芫菁俗称黄黑小斑蝥（MylabrisCichoriiLinnaeus），属于昆虫纲鞘翅目芫菁科（Coleopter：Meloidae）昆虫，是中国药典收录的重要的动物药之一，近年来因其体内所含的斑蝥素（Cantharidin）在临床医学中有显著的抗肿瘤作用而使这一资源昆虫的需求量大为增加，野生资源远不能满足人类需求。目前，对于芫菁科昆虫的人工养殖、斑蝥素的合成及应用等已有许多研究成果，但是，关于芫菁科昆虫的生理学、生物化学以及分子生物学方面的研究极为缺乏，有的领域完全是空白，对芫菁科昆虫在斑蝥素合成高峰期基因转录信息的研究能获取分子昆虫学方面的重要信息

2、，为研究芫菁科昆虫的滞育、斑蝥素生物合成过程等相关研究开辟新的道路，为实现芫菁的人工养殖、更好地挖掘芫菁资源乃至斑蝥素的人工合成奠定基础。本实验以羽化后25天左右的隔离饲养的雌、雄眼斑芫菁为材料，提取全虫的mRNA，经过反转录合成ss-cDNA，再经过LD-PCR技术合成ds-cDNA，取200bp以上的ds-cDNA与载体进行连接，连接产物电转化XL1-Blue大肠杆菌感受态细胞，构建了眼斑芫菁雌、雄成虫的全长cDNA文库。从两个文库各随机挑取30个克隆进行测序，经过处理最终共得到34条ESTs（Expressedsequencetags）序列，经过与数据库比对发现其中包括参与眼斑芫菁

3、重要生理功能的基因。主要研究结果如下：①成功构建了眼斑芫菁雌、雄成虫的cDNA文库，经检验文库质量符合要求，可以用来进行下一步的研究。②从两个cDNA文库中获得了部分EST序列，经过初步比对发现两个cDNA文库获得的EST序列在长度、预测功能等方面没有显著差异。合并雌、雄虫EST序列进行处理，再采用BlastX和BlastN程序与GeneBank数据库进行比对，有41%的序列与数据库中的已登录的基因序列有较高相似性，而有59%的EST序列与数据库中已登录序列相似性较低。说明眼斑芫菁有着比较独特的基因序列，而构建文库是发现新基因的高效的方法。其中包括细胞色素C氧化酶等对于研究眼斑芫菁生理生

4、化具有重要意义的基因序列（序列检索号：GW342329至GW342333）。③以眼斑芫菁细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ的基因序列为基础构建了系统进化树，证明鞘翅目芫菁科与鞘翅目叶甲科亲缘关系较近，鞘翅目与鳞翅目亲缘关系较近，这个结果与传统的昆虫分类方法相一致。关键词：眼斑芫菁，斑蝥素，SMART，cDNA文库，EST序列I重庆大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACTMylabrisCichoriiLinnaeus(Coleoptera:Meloidae)isanimportantChinesetraditionalmedicinelistedinthe

5、ple'sRepublicofChina>editedin2005(abbreviatedastheChinesePharmacopoeia;Ch.P.,2005)whichpotentcontentcantharidinishighlypoisonoustomostofanimals.Foritsextensiveusinginmedicine,therequirementhasupincreasedandthenaturalresourcesofMylabrisCichoriihavebeendramaticallydecreasedinChina.Therearealotofres

6、earchesachievedabouttherearingofMeloidaeinsects,cantharidinsynthesisandapplication.However,ithaslittleresearchaboutMeloidaephysiology,biochemistryandmolecularbiology,andevencompletelyblankinsomefield.Itstranscriptomicdataofcrest-timeofcantharidinbiosynthesiswouldprovideinvaluableinformationformol

7、ecularentomologyandpaveawayforthereserchofdiapauseofMeloidaeinsects,cantharidinbiosynthesisandsoon,anditwouldmakefoundationforachievingtheartificialbreedingofMeloidaeinsects,betterutilizationtheresourcesofcantharidinev