cdna文库与est序列分析

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1、cDNA文库构建及EST序列分析陈威、丁立建、黄显军、刘振英、毛海花、上官巧灵、朱竹君（按姓氏首字母排列，排名不分先后）组员任务分配陈威：统筹安排、资料收集丁立建：cDNA文库应用、资料收集黄显军：背景简介刘振英：cDNA文库构建原理、资料收集毛海花、上官巧灵、朱竹君：EST序列分析目录一、背景简介二、cDNA文库构建原理三、cDNA文库的应用四、EST序列分析五、参考文献cDNA文库构建及EST序列分析背景简介——黄显军cDNA基因文库：某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDN

2、A片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。1.cDNA文库背景简介1.1cDNA文库产生前的技术概况随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。在过去寻找新基因的方法有：a）消减杂交b）mRNA差异显示c）cDNA的代表性差异显示分析法d）差异消减展示等方法这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。1.2cDNA文库的产生由于以前技术的缺点，目前，比较可行而

3、且应用较多的方法主要是cDNA文库的筛选。一方面cDNA文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此cDNA克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多。另一方面由于每个cDNA克隆只代表一种mRNA序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低。所以cDNA文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。1.3.为什么要构建cDNA文库？cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接

4、用于该目的基因的表达。1.4.怎么构建cDNA文库？1.5.cDNA文库构建后能干什么？1)可保护濒危珍惜生物资源2)可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针3)可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究1.6.cDNA文库的优势及价值1）优势：cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势。2）价值：在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。2.EST序列分析背景简介克隆

5、全长cDNA序列的传统途径：a)噬斑原位杂交的方法b)采用PCR的方法缺点：工作量大、耗时、耗材这些传统方法已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。2.1.EST序列分析的产生随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前。采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提

6、供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。2.2.EST技术的作用价值EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实

7、践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。目录一、背景简介二、cDNA文库构建原理三、cDNA文库的应用四、EST序列分析五、参考文献cDNA文库的构建——刘振英为什么构建cDNA文库真核生物基因结构原核生物有很大差异。真核生物的基因不能直接在原核生物中表达,只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），并连接相应的原核细胞表达控制元件，才能在原核生物中表达。mRNA的不稳定性真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，因而对真核基因的表达和相关的mRNA

8、研究，一般都是通过对cDNA的研究来进行。But如何构建cDNA文库www.themegallery.comLOGOmRNA的分离制备寡聚胸苷酸〔oligo(dT)〕纤维素或琼脂糖亲和层析法，在高盐缓冲溶液中poly(A)＋RNA与oligo(dT)结合，低盐缓冲溶液使它们解离。www.themegallery.comLOGOcDNA第一链的合成Oligo（dT）引导的cDNA合成高浓度的Oligo（dT）引物与mRNA的3'末端的poly（A）配对。优点：逆转录反应基本被限定在以mRNA为模板