除虫菊花均一化cdna文库的构建与est序列分析

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1、ConstructionandESTsAnalysisofTheNormalizedcDNALibraryfromChrysanthemumCinerariifoliumFlowersAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomybyBianWanpingSupervisor:Prof.LiZhengguoMajor:GropGeneticsandBreedingCollegeofBioengineeringofC

2、hongqingUniversity,Chongqing,ChinaApril,2008重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要除虫菊（ChrysanthemumCinerariifolium）是菊科多年生草本植物，是目前世界上唯一集约化种植的杀虫植物。除虫菊的杀虫活性物除虫菊素（pyrethrins）具有高效、低毒、广谱、低残留等优良杀虫特性，对人、温血动物和环境没有危害，已成为当今无公害生物杀虫剂的重要研究热点之一。除虫菊素主要在除虫菊花中合成，其含量占整个植株的95%以上，而干花中除虫菊素含量在1.2-2.0%。目前，天然除虫菊素已广泛应用在农业、林业、生物农药和食品卫生安

3、全等多个领域。但国内外对于天然除虫菊素合成相关基因的研究很少，从而制约了利用基因工程技术提高除虫菊花中除虫菊素的含量。构建除虫菊花cDNA文库，可以为今后除虫菊素合成相关基因的研究奠定基础。本研究以除虫菊花为实验材料，经均一化处理，构建了除虫菊花的均一化cDNA文库，随机挑选部分克隆进行EST测序后，进行同源性比较和基因功能分析，得到以下结论：○1采用试剂盒柱离心法提取除虫菊花的总RNA，经过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，提取的除虫菊花总RNA有清晰的两条带28S与18S，而且两条带清晰锐利，没有拖尾，说明提取总RNA完整，没有降解。以总RNA为模板，利用SMARTⅣOli

4、gonuleotide和CDS-3Madapter为引物，在PowerScriptReverseTranscriptase作用下合成第一链cDNA并且进一步合成双链cDNA，用均一化酶DSN、限制性内切酶sfiI处理后，凝胶回收400bp以上的片段，浓缩后与载体pDNR-LIB载体连接，电转化转入大肠杆菌，获得除虫菊花cDNA原始文库。原始文库经扩增后，所得扩增文库置于-80℃超低温冰箱中保存。○2将得到的原始文库按比例稀释后铺平板并于37℃下过夜培养，计算单菌落数。得出原始文库滴度为2.8×105pfu/mL，重组率为96%。利用载体的M13引物进行PCR扩增，得到该文

5、库的大部分插入片段大小在0.4-1.3kb。采用相同的方法测定cDNA扩增文库的滴度约为2.0×109pfu/mL。○3从文库中随机挑取部分克隆，经PCR检测都有外源插入片段。对65个阳性克隆采用T7作为测序引物，从cDNA5'端进行测序，得到61个EST序列，经过比较拼接后有3条序列分别是由2个EST拼接而成，最终得到有效序列58个。○4通过BLASTX与NCBI的GeneBank数据库中现有的ESTs进行同源性分析表明，所得的58个ESTs序列中有48（82.3%）个具有同源序列，其中40个序列有明确的功能注释，8个为未知功能基因，有10个（17.2%）ESTs序列未

6、找到I重庆大学硕士学位论文中文摘要同源序列。关键词：除虫菊，SMART技术，均一化，cDNA文库，EST序列II重庆大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACTPyrethrum(ChrysanthemumCinerariifolium)isaspeciesofperennialherbageplants,andasoleindustrialinsecticidalplantallovertheworld.Becauseofexcellentinsecticidalcharacteristicsofpyrethrins,includinghighefficiency,lowt

7、oxin,broad-spectrum,lowresidues,andalowimpactonthehumanbeingandenvironment,pyrethrinshavebecomeoneofthemostimportantbiologicinsecticides.Thepyrethrinsaremainlysynthesizedinpyrethrumflowersandthecontentismorethan95%.Thecontentinthedriedflowersisabout1.2-2.0%.Atpresen