以长链pcr为基础利用融合pcr扩增乙型脑炎病毒全长cdna

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1、中国生物制品学杂志2008年12月第21卷第12期ChinJBiologicalsDecember2008，Vol.21No.12·1047·中国图书分类号Q789R373.3+1文献标识码A文章编号1004-5503（2008）12-1047-05【基础研究】以长链PCR为基础利用融合PCR扩增乙型脑炎病毒全长cDNA12222李静俞永新安琪杨力宏孔艳【摘要】目的以长链PCR（Long-PCR）技术为基础，应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒（JEV）全长基因组。方法根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物，分别扩增JEVSA14-14-

2、2株的5′和3′半长分子，在5′端上游引物中引入T7启动子核心序列。利用细胞培养增殖病毒，提取病毒RNA，逆转录后采用LongPCR方法得到JEV的5′和3′两个半长分子，在此基础上进行融合PCR，得到JEV全长cDNA分子，克隆入pGEMT-easy载体，酶切鉴定并测序。结果扩增出均6000bp的JEV的5′和3′两个半长分子及约11000bp的全长cDNA片段，其二级结构丰富的非编码区未发生缺失。JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性最高达99％，其氨基酸序列同源性最高达96.3%。其E蛋白基因与野毒株和减毒株进

3、行比较，核苷酸序列同源性高达98％～99％，氨基酸序列也未出现较大差异。结论已获得了乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长基因组，为进一步构建感染性克隆奠定了基础。【关键词】乙型脑炎病毒；全长cDNA；长链PCR；融合PCRAmplificationofFull-lengthcDNAofJapaneseEncephalitisVirusbyLongPCR-basedFusionPCR△△LIJing,YUYong-xin,ANQi,etal（WuhanInstituteofBiologicalProducts,Wuhan430060,China）【Abs

4、tract】ObjectiveToamplifythefull-lengthcDNAofJapaneseencephalitisvirus（JEV）bylongPCR-basedfusionPCR.MethodsTheprimersweredesignedaccordingtothefull-lengthcDNAofJEVreportedinGenBank,andthecoresequenceofT7promoterwasintroducedtotheupstreamprimerat5'-terminus.JEVstrainSA14-14-2wasin

5、oculatedtoVerocellsforproliferation,andviralRNAwasextractedforreversetranscriptionandamplificationofhalf-lengthof5'and3'genesequencesofJEVbylongPCRrespectively,basedonwhichthefull-lengthofJEVcDNAwasobtainedbyfusionPCRandclonedintopGEMT-easyvector.Theconstructedrecombinantplasmid

6、wasidentifiedbyrestrictionanalysisandsequencing.ResultsThe5'and3'genefragmentseachatalengthofabout6000bpaswellasfull-lengthcDNAofabout11000bpwereamplified.Nogenedeletionwasobservedinthesecondarystructure-richnon-encodingregion.Thehomologiesofnucleotideandaminoacidsequencesofthea

7、mplifiedfull-lengthcDNAwere99%and96.3%tothoseofrelevantstraininGenBankrespectively.ThenucleotidesequenceofEgeneshowedahomol－ogyof98%-99%tothoseofwildandattenuatedstrain,whileaminoacidsequenceshowednosignificantdifference.ConclusionThefull-lengthofcDNAofJEVstrainSA14-14-2wasampli

8、fied,whichlaidafoundationoffurtherconstructiono