革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用

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1、革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用王景1a穆媛媛2a黎庶1陈志瑾1熊坤丛延广1国家自然科学基金资助项目（30500435）作者单位：王景（1985-），女，重庆市人，硕士研究生，助教，主要从事细菌致病机制方面的研究。电话：023-68771935a共同第一作者通讯作者：丛延广，电话：023-68752241,Email:ygcong@tmmu.edu.cn（1第三军医大学基础医学部微生物学教研室，重庆400038；2遵义医学院，遵义563003）摘要：目的构建一个适用于革兰阴性菌的精确基因敲除载体并证明其有效性。方法构建的载

2、体主要包括以下成分：π蛋白依赖性复制起点oriR6K；接合转移基因mob，使载体可以通过简单的接合方式实现转移；多克隆位点序列：EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-SacⅠ-NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-SacⅡ-BglⅡ；反向选择标志SacB；正向选择标志卡那霉素。载体构建完成后，采用该载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行框架内敲除，以验证其有效性。结果成功构建了敲除载体，命名为pYG4，并对yeeZ基因进行框架内精确敲除获得突变株。结论本研究构建的载体适用于对革兰阴性菌进行目的基因的精确敲除，将在细菌基因功能研究中

3、得到广泛的应用。关键词：敲除；载体构建Constructionandapplicationofavectorforgenedeletioningram-negativebacteriaWANGJing*,MUYuan-yuan*,LIShu,CHENZhi-jin,XIONGKun,CONGYan-guang.*DepartmentofMicrobiology,ThirdMilitaryMedicalUniversity.Chongqing400038.*ZunyiMedicalCollege.Zunyi563003.)Cor

4、respondingauthor:CONGYan-guangEmail:ygcong@tmmu.edu.cn[Abstract]ObjectiveToconstructavectorplasmidwhichfacilitategeneratingprecisedeletioninthegenesofgram-negativebacteria.MethodsThevectorisbasedontheoriginofreplicationthepprotein-dependentoriginofplasmidR6K.Itwilln

5、otreplicateinbacteriaotherthanpprotein-producingbacteriaandfunctionas'suicide'vector.Thevectorcarrythemobregionfromthebroad-host-rangeplasmidRP4andisthusmobilizablebyconjugationintoawiderangeofGram-negativebacteria.Amultiplecloningsitesisavailableonthevector.Thevect

6、orcontainsakanamycinresistancemarkerfororthoselectionandcontainsasacBgeneforinverseselection.Inthepresentstudy,thevectorwasusedtocarryoutgenedeletionexperimentintheyeeZgeneofCitrobacterfreundii.ResultsThevectorplasmidwasconstructedsuccessfullyandnamedbypYG4.Itdidwor

7、kinthegenedeletionexperiment.ConclusionThevectorplasmidconstructedinthepresentstudyisusefulandconvenientforgeneratinggenedeletioningram-negativebacteria.[Keywords]Genedeletion;Vectorconstruction;众多细菌的全基因组测序为深入认识这些细菌的生命活动规律奠定了基础，但到目前为止，对已测序基因的功能认识还很不足[1,2]。认识细菌基因功能的基

8、本方法就是对细菌基因进行原位的突变分析，一般采用同源重组方式。对于酵母以及少数天然感受态细菌的基因突变相对简单，因为它们可以进行线性DNA的转化，然而大多数细菌由于胞内核酸外切酶（降解线性DNA）的存在，是不易进行线性DNA转化的，除非提前对细菌进行核酸酶的突变操作。对于这一