木薯MeP5CS1基因的克隆、表达分析及载体构建

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1、—４０—江苏农业科学２０１７年第４５卷第１８期丁泽红，付莉莉，黄猛，等．木薯ＭｅＰ５ＣＳ１基因的克隆、表达分析及载体构建［Ｊ］．江苏农业科学，２０１７，４５（１８）：４０－４３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１７．１８．００９木薯ＭｅＰ５ＣＳ１基因的克隆、表达分析及载体构建丁泽红，付莉莉，黄猛，颜彦，铁韦韦，张家明，胡伟（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口５７１１０１）摘要：对从木薯Ｋｕ５０叶片中克隆的１个Ｐ５ＣＳ基因ＭｅＰ５ＣＳ１进行聚乙二醇（ＰＥＧ）、脱落酸（ＡＢＡ）、盐胁迫下的表达

2、分析，结果表明，基因ＭｅＰ５ＣＳ１具有１个２２２０ｂｐ的开放阅读框，编码７３９个氨基酸，且含有Ｐ５ＣＳ保守结构域；ＭｅＰ５ＣＳ１与杨树、杞柳的Ｐ５ＣＳ基因亲缘关系相对较近，序列相似性分别达到８８．６１％、８８．９５％；ＭｅＰ５ＣＳ１基因在第１张完全展开叶、老叶中的表达量受到ＰＥＧ处理诱导，且与叶片中脯氨酸的含量变化趋势一致；ＭｅＰ５ＣＳ１基因的表达还受到脱落酸（ＡＢＡ）、盐胁迫处理的诱导。在此基础上，成功构建ＭｅＰ５ＣＳ１基因的植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３００－ＭｅＰ５ＣＳ１，为进一步解析ＭｅＰ５ＣＳ１在木薯抗旱中的作用机制提供参

3、考。关键词：木薯；ＭｅＰ５ＣＳ１；非生物胁迫；克隆；基因表达；载体构建中图分类号：Ｓ５３３．０１文献标志码：Ａ文章编号：１００２－１３０２（２０１７）１８－００４０－０３干旱是世界农业面临的最严重问题之一。随着全球发生１．１试验材料的准备周期性降水分布不均、水资源受到污染等现象，植物面临干旱试验材料为木薯栽培品种Ｋｕ５０，由中国热带农业科学院胁迫的程度日益加剧，不但导致农作物产量严重减少，而且还热带生物技术研究所提供，在木薯种植季节，将Ｋｕ５０种茎切［１］使得旱地面积持续扩大，制约着农业的可持续发展。在漫成长度约１５ｃｍ的茎段，挑选

4、含３～４个芽眼／茎段、粗细均匀长的环境适应和驯化过程中，植物形成了多种生理生化策略一致的茎段，扦插于高为１８．８ｃｍ，上、下直径分别为１８．５、以应对干旱胁迫，如当植物遭受长时间和较为严重的干旱时，１４．８ｃｍ的塑料盆中，１茎段／盆。基质采用营养土与蛭石以植物冠层的光合作用将显著减少；为尽快适应缺水的情况，植１∶１的体积比进行混合。木薯种植约１０ｄ进行间苗，保留物通过老叶的脱落来减少水分消耗，或增加根长来吸收更深１苗／盆。［２］层的地下水，脯氨酸等各种小分子化合物将被合成并迅速１．２试验处理［３］积累以保持细胞中的含水量等等。木薯盆

5、栽种植６０ｄ，选取长势一致的植株用２０％脯氨酸是植物面对水分、高盐等逆境胁迫最为重要的渗ＰＥＧ６０００溶液模拟干旱胁迫，以浇灌自来水为对照，分别在［１０］透调节物质，提高植物中脯氨酸的积累对提升植物抗渗透胁处理０、３、６、１２、２４ｈ时，按照Ｂａｔｅｓ等的方法测定叶片脯迫能力具有重要的意义。Δ１－吡咯啉－５－羧酸合成酶氨酸含量，同时，分别在处理０、３、２４ｈ时采集未展开叶、第１（Ｐ５ＣＳ）是植物脯氨酸生物合成途径中的关键酶，决定着植物张完全展开叶、老叶、根。此外，对种植６０ｄ的木薯幼苗用［４］体内脯氨酸的积累速度。目前，对很多植物中

6、的Ｐ５ＣＳ基１００μｍｏｌ／ＬＡＢＡ喷施，在处理０、２、６、１０、２４、４８、７２ｈ时采集［５－７］因研究较为深入，并发现Ｐ５ＣＳ转基因植株的抗逆性表未展开叶、第１张完全展开叶、老叶；另用２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ［８－９］型增强。木薯是重要的粮食作物和经济作物，虽具有一进行灌根，在处理０、２、６ｈ及３、１４、１８、２４ｄ同样采集叶片。定的抗旱特性，但同大多数作物一样，干旱胁迫仍严重地影响根、叶样品液氮冷冻、－８０℃保存，待测。［２］木薯的生长和发育，导致木薯块根产量减少，而与模式植１．３ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ合成物相比，木薯的重要经

7、济性状基础理论研究还相对薄弱，与抗按照天根生化科技有限公司生产的ＲＮＡ提取试剂盒说旱相关的分子机制尚不明确。本研究在克隆木薯Ｐ５ＣＳ基因明书提取木薯的总ＲＮＡ；利用Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司生产的第一链ＭｅＰ５ＣＳ１的基础上，分析ＭｅＰ５ＣＳ１基因在聚乙二醇（ＰＥＧ）、ｃＤＮＡ合成试剂盒（ｒｅｖｅｒｔａｉｄｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ）将脱落酸（ＡＢＡ）和盐胁迫条件下的表达量变化，并构建相关的总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，－２０℃储存，备用。植物表达载体，为进一步解析木薯的抗旱机制提供参考。１．４引物设计与实时荧光

8、定量聚合酶链式反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）用Ｐｒｉｍｅｒ６．０设计引物，由生工生物工程（上海）股份有１材料与方法限公司进行合成。ＭｅＰ５ＣＳ１基因全长扩增正向、反向引物分别为Ｌ１：５′－ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＣＴ