木薯醇腈酶cdna的克隆及其表达载体的构建

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1、木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建作者：王丹　何浪　王玉明　潘克俭　李维【摘要】　　目的克隆木薯醇腈酶（HNL）cDNA构建表达载体，以实现木薯醇腈酶基因的高效表达。方法运用RT-PCR从木薯幼叶组织中扩增出HNL全长cDNA序列，将其克隆至质粒pBluescriptSK中进行序列分析，再利用PCR将其再克隆到酵母表达质粒pPIC3.5K上。结果经测序分析表明，克隆的cDNA片段和Lane1:λDNA/HindIIImarker;Lane2:RT-PCRproductLane3:pBS/EcoRI;Lane4:pBS-HNL/EcoRI＋BamHI图2电泳分析RT-PCR产物及限

2、制酶切分析阳性克隆Fig.1ElectrophoresisanalysisofproductbyRT-PCRandanalysisofpositivecloningbyrestrictiveenzymetechnique2.2表达载体的构建为了在甲醇酵母中表达木薯HNL，根据质粒pPIC3.5K限制酶分布位点的特点，设计如下引物：上游引物Hnl-35′-gcggatccatggtaactgcac-3′下游引物Hnl-45′-gcgaattcaagcatatgcatc-3′其中上游引物引入BamHⅠ酶切位点，下游引物加上EcoRⅠ位点，以质粒pBS-HNL为模板进行PCR扩增，得到两端

3、分别含有BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点的HNL片段，将其双酶切后与经同样处理的pPIC3.5K连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含有氨苄的LB平板，培养过夜，待长出单菌落后，挑取单菌落于液体LA中，培养16h，提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳，选取增大的质粒DNA，为可能的重组子。用限制性酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切鉴定，酶切产生了0.8Kb的片断，与预期相符（图4）。证明为所需的重组子，命名1道:经HindⅢ酶切的λDNA标准;2道:无;3道:pPIC3.5K-HNL/BamHⅠ+EcoRⅠ;4道:pPIC3.5K-HNL/BamHⅠ图4酶切鉴定重组子pPIC3.5K-HN

4、LFig.4RegestiondetectionofpPIC3.5K-HNL为pPIC3.5K-HNL，其构建流程见图5。图5重组质粒pPIC3.5K-HNL的构建流程Fig.5ThecourseofConstructionofrebinantplasmidpPIC3.5K-HNL3讨论已有的研究结果表明，木薯基因组中含有多个HNL基因成员，已确定序列的有至少3个成员，包括mehnl10,mehnl14,mehnl24以及clonhnl（可能为新成员）。将本研究获得的醇腈酶cDNA与已报道的，同源性较高的序列进行了序列比较，结果显示与Me-HNL10cDNA序列的同源性为99.1%，氨基

5、酸序列同源性为98.8%，与colnhnlcDNA序列的同源性为98.8%，氨基酸序列同源性为98.1%。但根据同源性比较结果，我们还不能确定本研究中克隆的HNL属于其中的哪一类成员。甲醇酵母（pichiapastoris）表达系统是一种较好的外源基因表达系统，它的蛋白质加工方式和高图3克隆的木薯HNLcDNA序列及推测的氨基酸序列Fig.3Nucleotideanddeducedaminoacidsequencesofα-hydroxynitrilelyasecDNAfromcassava阴影部分表示:克隆到的木薯HNLcDNA序列与Me-HNL10cDNA相比,碱基对不同的部分;黑体

6、部分表示：与colnhnlcDNA相比,碱基对不同的部分.方框部分表示:根据克隆的木薯HNLcDNA序列所推测的其氨基酸序列与Me-HNL10相比不同的部分;下划线表示:与colnhnl相比不同的部分。ShadoinoacidsequencesparedtoMe-HNL10;Underline:thedifferentpartofdeducedaminoacidsequencesparedtocolnhnl.等真核生物相似，为理想的高等真核蛋白表达系统［9］。目前国外从多种植物中克隆了HNL基因,其中Hasslacher等将来自三叶胶的HNLcDNA分别在大肠杆菌、酿酒酵母和甲醇酵母中实

7、现了表达，研究结果表明三叶胶HNLcDNA在甲醇酵母中表达量最高，目的产物可达可溶性总蛋白的30%［10］；而Haughes等在大肠杆菌中表达了来自木薯的hnl基因［11］。国内也有研究报道在大肠杆菌中表达木薯HNL基因，酶活力为2100U/L发酵液［8］，但无在甲醇酵母中表达的报道。为了进一步提高木薯HNL的表达量，本项研究将木薯HNL插入到甲醇酵母pPIC3.5K中，成功构建甲醇酵母表达载体，下一步将构建工程菌，完善发酵条件，以