烟草phot2基因cdna片段的克隆与rnai表达载体的构建

《烟草phot2基因cdna片段的克隆与rnai表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、烟草PHOT2基因cDNA片段的克隆与RNAi表达载体的构建乔新荣１，陈琼１，郭桥燕２，徐长水３（１．信阳农林学院，河南信阳４６４０００；２．河南省烟草公司平顶山市公司，河南平顶山４６７０００；３．河南大学生命科学学院／植物逆境生物学重点实验室，河南开封４７５００４）摘要：采用生物信息学方法，以番茄（Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＰＨＯＴ２基因序列为探针，比对了烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）ＥＳＴ数据库，并根据获得的同源性较高的ＥＳＴ序列设计引物，ＰＣＲ扩增了烟草Ｋ３２６ＰＨＯＴ２基因的ｃＤＮＡ片段。结果表明，成功扩增出了ＰＨＯＴ２基因的ｃＤＮＡ片段，并构建了干扰烟草ＰＨ

2、ＯＴ２基因表达的ＲＮＡｉ表达载体。.jyqkail__"href="/cdn-cgi/l/email-protection"data-cfemail="1afeb9b36273746875747d222a2c5a2b2c2934797577">[email protected]。光是调节植物生长发育的一个重要环境因子，植物中已分离了４种对不同波长光感知的受体，分别为光敏色素（Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ，ＰＨＹ）［１］，隐花色素（Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ，ＣＲＹ）［２］，向光素（Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ，ＰＨＯＴ）［３］和Ｚｅｉｔｌｕｐｅ蛋白家族［４］，其中ＰＨＯＴ是感知蓝光的受体蛋白激酶

3、。在模式植物拟南芥中研究表明，ＰＨＯＴ１和ＰＨＯＴ２以功能冗余方式调节弱光下的叶绿体聚积运动（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｍｏｖｅｍｅｎｔ），使吸收光能的叶绿体面积达到最大，提高了弱光下植物的光合作用［５］。而ＰＨＯＴ２强光下单独介导叶绿体回避运动（Ａｖｏｉｄａｎｃｅｍｏｖｅｍｅｎｔ）［６］，使叶绿体从强光下移开，沿细胞垂周壁排列，与光源平行，保护光合器官免受强光损伤［７］。另外，ＰＨＯＴ２参与调节草莓果实中花青素的积累［８］。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）技术通过反义ＲＮＡ与正链ＲＮＡ形成双链ＲＮＡ，特异性地降解细胞内同源ｍＲＮＡ，从而阻断靶基因的表达，使靶基因发生沉默

4、，表现出特定基因缺失的表型。ＲＮＡｉ技术可以快速分析靶基因的功能，这为高效研究植物功能基因组提供了方便，成为反向遗传学研究的重要工具之一［９］。本研究以烟草Ｋ３２６为材料，克隆了烟草ＰＨＯＴ２基因片段，构建了ＲＮＡｉ干扰载体，为验证ＰＨＯＴ２介导的叶绿体回避运动是高等植物普遍的运动提供了证据，同时也为ＰＨＯＴ２可能参与烟草香气形成、烟叶品质重要调节子的研究奠定了基础。１材料与方法１．１材料１．１．１植物材料烟草Ｋ３２６。１．１．２菌种和质粒大肠杆菌菌株ＤＨ５α，ＲＮＡｉ干扰载体ｐＦＧＣ５９４１为河南大学逆境生物学重点实验室保存；克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔｓｉｍｐｌｅ购自宝生物工程（大连）有限公司

5、。１．１．３试剂限制性内切酶、ＯｌｉｇｏｄＴ１８引物、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＤＮＡ凝胶纯化回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；高效连接试剂盒ＳｏｕｌｔｉｏｎＩ和Ｍ－ＭＬＶ反转录酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＫＯＤ－ｐｌｕｓＤＮＡ聚合酶购自ＴｏＹｏＢｏ公司；抗生素（Ａｍｐ，Ｋａｎ）购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、普通ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ购自天根生化科技（北京）有限公司。１．１．４引物本研究使用引物见表１。１．２方法１．２．１ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成取烟草Ｋ３２６幼苗０．１ｇ，液氮研磨，利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂进

6、行ＲＮＡ提取，提取的总ＲＮＡ用ＤＮａｓｅⅠ处理去除ＤＮＡ污染，并从电泳检测其质量，合格的总ＲＮＡ进行反转录，合成ｃＤＮＡ第一链，－２０℃保存备用。１．２．２烟草ＰＨＯＴ２基因ｃＤＮＡ片段扩增以番茄（Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＰＨＯＴ２基因序列（ＣＤＳ）作为探针，在ＴＩＧＲ网站上ＢＬＡＳＴ搜索烟草ＥＳＴ数据库，获得与探针序列同源性较高ＥＳＴ序列，进行引物设计。以烟草Ｋ３２６ｃＤＮＡ为模板，利用引物Ｆ１和Ｒ１进行ＲＴ－ＰＣＲ。将ＰＣＲ产物克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，将经菌落ＰＣＲ和质粒ＰＣＲ鉴定后得到的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限

7、公司测序。１．２．３ＲＮＡｉ表达载体的构建、鉴定与转化根据测序结果，以克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体的重组质粒为模板，以引物Ｆ２和Ｒ２作为正向引物，Ｆ３和Ｒ３为反向引物。将引物Ｆ２和Ｒ２进行ＰＣＲ扩增的片段与ｐＦＧＣ５９４１ＲＮＡｉ载体进行连接、转化及酶切验证后，将得到的重组质粒ｐＦＧＣ５９４１－Ｔ１测序验证。然后按照相同的方法，将Ｆ３和Ｒ３引物扩增的相同片段克隆至测序正确的ｐＦＧＣ５９４１－Ｔ１质粒上，经检验测序