菠菜胆碱单加氧酶基因cdna的克隆及重组植物表达载体的构建

《菠菜胆碱单加氧酶基因cdna的克隆及重组植物表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、http://www.paper.edu.cn菠菜胆碱单加氧酶基因cDNA的克隆及重组植物表达1载体的构建1，21，22，3柳娜，王蒂，司怀军1甘肃农业大学农学院，兰州（730070）2甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州（730070）3甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州（730070）E-mail：wangd@gsau.edu.cn摘要：从菠菜叶片中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增到菠菜胆碱单加氧酶（CMO）基+因cDNA，然后将CMOcDNA克隆至pBluescriptSK载体上，序列分析结果表明该CMOcDNA全长为1424bp，开

2、放阅读框1320bp，编码440个氨基酸。核酸序列同源性分析表明，该cDNA与已发表的菠菜CMO基因具有99.8%同源性，氨基酸序列同源性达99.6%。在此基础上以pBI121和pBIrd为基础，构建了组成型启动子CaMV35S和逆境诱导表达启动子rd29A驱动的CMO基因的植物表达载体。关键词：菠菜；胆碱单加氧酶基因；克隆；表达载体构建干旱和盐碱是影响植物生长发育最主要的非生物胁迫因子，许多植物对干旱和盐碱比较敏感，缺乏有效的抗旱机理，从而造成作物产量的严重损失。但某些高等植物在盐、干旱等渗透胁迫下，可以大量合成并积累甜菜碱作为无毒的渗透调节剂，起着

3、调节渗透压，保护胞[1]内酶活性的作用。甜菜碱是甘氨酸的衍生物,被认为是最好的渗透调节剂。在高等植物中，甜菜碱经两步酶催化得到，即胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱，催化第一步反[2-3]应的酶是胆碱单加氧酶（cholinemonooxygenase，CMO）,催化第二步反应的酶是甜菜碱[4-6]醛脱氢酶（betainealdehydedehydrogenase,BADH），这两种酶是控制甜菜碱合成的两个[7]关键酶。Rathinasabapathi等首先从菠菜叶片中克隆了CMO的完整cDNA，该cDNA全[8][9]长1622bp。随后，藜科的甜菜、山菠菜CMO

4、cDNA全序列也被克隆并分析其序列，发现不同植物之间CMO基因及氨基酸序列同源性较高。本研究从菠菜叶片中克隆了CMO基因，并构建了组成型启动子CaMV35S和逆境诱导表达启动子rd29A驱动的CMO基因的植物表达载体，以进一步转化农作物，提高其抗旱耐盐能力。1.材料和方法1.1实验材料1.1.1植物材料、质粒和菌株菠菜（SpinaciaoleraceaL.）种子来自市场销售的种子，种植于温室内；质粒pBluescript+SK、pBI121（含CaMV35S启动子）、pBIrd（含rd29A启动子）由实验室司怀军老师提供；大肠杆菌为DH5α。1.1.2

5、主要试剂TMTrizol试剂盒、反转录试剂盒、各种限制性内切酶、PyrobestDNA聚合酶、Taq聚合酶、X-gal、IPTG、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒购自鹏程公司。1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金项目（20050733003）和甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2006-01）的资助。-1-http://www.paper.edu.cn1.1.3培养基和培养条件大肠杆菌培养基为LB培养基，培养温度37℃，摇床转速200r/min，氨苄青霉素（Amp）浓度为50mg/ml，卡那霉素（Kan）浓度为

6、50mg/ml。1.2实验方法1.2.1PCR引物的设计利用Primer软件，根据已报道的菠菜CMOcDNA序列（GenBankaccessionno.U85780）设计了一对20mer的引物，上游引物L1：5´-AAAAGGAAGTGTTGAGTTGG-3´，下游引物L2：5´-TTTAGGCCATGAGCATACAC-3´，提交上海生物工程有限公司合成。1.2.2RT-PCR扩增CMO基因采用Trizol法从菠菜中提取总RNA，然后通过RT-PCR反转录成cDNA。以反转录的cDNA为模板，用设计好的上下游引物扩增CMO基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测

7、扩增结果。1.2.3中间载体的构建及DNA序列测定+将PCR产物平端克隆至pBluescriptSK载体的SmaI位点，然后转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选及PCR扩增产物电泳检测，挑选阳性菌株扩增后用小量法提取质粒，进行酶切鉴定及序列测定，序列测定由上海生物工程有限公司完成。1.2.4CMO基因植物表达载体的构建+用EcoRV（平末端）和SacI（粘末端）双酶切重组质粒pBluescriptSK-CMO，得到CMO基因的全长片段，用SmaI（平末端）和SacI（粘末端）双酶切pBI121载体（含组成型启动子CaMV35S）和pBIrd载体（含逆境诱

8、导型启动子rd29A），切去其中的GUS基因，回收载体大片段和CMO基因片段，连接、转化感受态